沈?qū)W文 ，劉愛(ài) ，鄔艷 ，劉靜 ，余曉慧

(1.寧波市奉化區(qū)中醫(yī)院消化科，浙江 寧波 315500；2.寧波市奉化區(qū)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，浙江 寧波315500；3.南昌市東湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330006；4.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006；5.瑞昌市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西九江332200)

原發(fā)性肝癌惡性程度高，惡化速度快，我國(guó)其發(fā)病率在各種惡性腫瘤中位居第二。外科手術(shù)是目前最有效的肝癌治療措施,但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率卻可超過(guò)70%，因此肝癌預(yù)后極差[1]。國(guó)內(nèi)外研究表明轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響肝癌患者生存率的主要因素,這與肝癌的高度血管浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移傾向密切相關(guān)[2]。

肝癌轉(zhuǎn)移前期僅有少量癌細(xì)胞或癌細(xì)胞團(tuán)存在于外周血液[3]，影像、病理等常規(guī)檢查方法不能發(fā)現(xiàn)，最近研究顯示，通過(guò)高度敏感、特異的基因檢測(cè)技術(shù)能檢測(cè)到肝癌早期轉(zhuǎn)移時(shí)血液中腫瘤相關(guān)基因的mRNA[4,5]，從而為肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)爭(zhēng)得寶貴的治療先機(jī)。

本研究通過(guò)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者外周靜脈血中游離的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 和基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）mRNA，探索它們?cè)诟伟┰缙谵D(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

1.1.1 收集本院2016年10月至2018年10月收治的16例經(jīng)病理方法確診為原發(fā)性肝癌伴轉(zhuǎn)移的患者外周血5ml，以EDTA-2K抗凝，作為肝癌轉(zhuǎn)移組標(biāo)本?；颊吣挲g36～86歲，中位數(shù)年齡68.5歲，其中男11例，女5例；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移14例，肝外轉(zhuǎn)移2例。

1.1.2 收集同期經(jīng)病理方法確診為原發(fā)性肝癌但無(wú)轉(zhuǎn)移的患者16例，抽取外周血5ml，以EDTA-2K抗凝，作為肝癌無(wú)轉(zhuǎn)移組標(biāo)本?；颊吣挲g31～89歲，中位數(shù)年齡63歲，其中男10例，女6例。

1.1.3 收集性別、年齡構(gòu)成相仿的健康體檢者外周血16例，每例5ml，以EDTA-2K抗凝，作為健康對(duì)照組標(biāo)本。

1.1.4 三組研究對(duì)象在性別、年齡構(gòu)成等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 上述新鮮血液樣本置4℃保存，48h內(nèi)用Ficoll密度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，分離方法如下：以Hank’s液按1：1的比例稀釋全血標(biāo)本，緩慢滴加到含F(xiàn)icoll溶液的15ml離心管中，F(xiàn)icoll和血液體積比為 1：2，400g，4℃離心 30min，用滴管吸取血清和Ficoll交界的單個(gè)核細(xì)胞層，以Hank’s液洗滌一次后用凍存液置于-80℃凍存。用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA。檢測(cè)RNA質(zhì)量后行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè) VEGF基因擴(kuò)增引物為, 上游：5′-GAT CGA GTA CTA CTT CAA GCC-3′, 下游：5′-TTG TTG TGC TGT AGG AGG C-3′；EMMPRIN基因擴(kuò)增引物為，上游：5′-CCG GTC AGA GCT ACA CAT TGA-3′, 下游：5′-TCT TGC CTT TGT CAT TCT GGT-3′；反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)；以GAPDH表達(dá)量為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)雙delta法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 Real Time PCR每次測(cè)定均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)以SPSS12.0進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法為兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)和四格表卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF和EMMPRIN的相對(duì)表達(dá)情況 與健康對(duì)照組相比，VEGF和EMMPRIN在肝癌無(wú)轉(zhuǎn)移組和肝癌轉(zhuǎn)移組均顯著高表達(dá)，VEGF在兩組中的相對(duì)表達(dá)量分別為 2.44±0.47 和 5.78±0.41，EMMPRIN 為 4.21±1.06和 7.34±1.26。在健康對(duì)照組、肝癌無(wú)轉(zhuǎn)移組和肝癌轉(zhuǎn)移組,組間兩兩比較,VEGF和EMMPRIN表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1。

圖1 VEGF和EMMPRIN mRNA表達(dá)量

2.2 外周血VEGF和EMMPRIN mRNA監(jiān)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移的評(píng)價(jià) 健康對(duì)照組與肝癌無(wú)轉(zhuǎn)移組、健康對(duì)照組與肝癌轉(zhuǎn)移組、肝癌無(wú)轉(zhuǎn)移組與肝癌轉(zhuǎn)移組中VEGF和EMMPRIN mRNA的表達(dá)經(jīng)卡方檢驗(yàn)P值均小于0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 VEGF和EMMPRIN mRNA在各組中的表達(dá)情況

3 討論

肝臟腫瘤中肝細(xì)胞癌是典型的富血管的腫瘤,血管生成因子對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有重要的調(diào)控作用，尤其是VEGF基因[6]。VEGF是一種選擇性血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原,是目前已知的最直接的血管生成活性蛋白,多數(shù)研究認(rèn)為其表達(dá)水平增高可以促進(jìn)腫瘤血管的增生,使腫瘤微血管密度增加，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7-8]。我們的研究顯示，在外周血中，與健康對(duì)照組相比，VEGF在肝癌組和轉(zhuǎn)移組均顯著高表達(dá),并且轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量還明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移組,這說(shuō)明肝癌患者外周血中的VEGF水平可能對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移具有一定的提示作用。但有文獻(xiàn)顯示，VEGF在正常人組織和血漿滲出液中均有低水平，且穩(wěn)定的表達(dá)[9]，我們的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，雖然VEGF在肝癌轉(zhuǎn)移檢測(cè)中具有較好的靈敏度，但其特異性稍顯不足。因此，本研究中我們同時(shí)檢測(cè)了肝癌患者外周血中的EMMPRIN基因的表達(dá)。

EMMPRIN，又稱(chēng)CD147，為免疫球蛋白超家族成員之一,其可通過(guò)成纖維細(xì)胞刺激合成基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移[10],是當(dāng)前侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制中研究的熱點(diǎn)之一[11-12]。已有文獻(xiàn)證實(shí)其在肝癌組織中有較高的表達(dá)[13-15]，但有關(guān)其在肝癌患者循環(huán)血液中的表達(dá)研究還比較少。我們的研究顯示，EMMPRIN與VEGF在肝癌患者中的表達(dá)相類(lèi)似，與健康對(duì)照組相比，其顯著高表達(dá)于肝癌組和肝癌轉(zhuǎn)移組。值得注意的是，EMMPRIN基因有很好的特異性，在本研究中的健康對(duì)照組中僅有一例陽(yáng)性表達(dá)，當(dāng)然，其特異性到底有多高還有待于更大樣本量的研究。

綜上所述,檢測(cè)肝癌患者外周血中VEGF mRNA對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)的敏感度較高，而EMMPRIN mRNA的檢測(cè)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)又具有較好的特異度，因此聯(lián)合檢測(cè)肝癌患者外周血中VEGF和EMMPRIN mRNA對(duì)肝癌的早期轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)具有一定的應(yīng)用價(jià)值。