周獻(xiàn)青 ，楊明 ，晏強(qiáng) ，陳潔晶 ，戴勇 ，黃錦龍

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二四醫(yī)院腎臟科，全軍器官移植與透析治療中心，廣西代謝性疾病研究重點實驗室，廣西 桂林 541002；3.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 518020)

腫瘤疾病發(fā)展成為嚴(yán)重威脅人類生命健康和生存發(fā)展的重大因素,目前全世界的腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢,廣西惡性腫瘤防治的重點癌癥疾病有肺癌，乳腺癌，鼻咽癌，宮頸癌等[1,2]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。在控制腫瘤細(xì)胞生長過程中，細(xì)胞免疫發(fā)揮重要作用，T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫尤為重要。T淋巴細(xì)胞可以反映人體細(xì)胞的免疫功能,是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵[3]。如惡性腫瘤、血液疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病等[4]；非特異性免疫細(xì)胞也反映了腫瘤細(xì)胞的殺傷能力和巨噬細(xì)胞的殺菌活性。本研究就桂北地區(qū)（桂林市、賀州市）的四種常見惡性腫瘤（鼻咽癌，乳腺癌，宮頸癌和肺癌），通過流式細(xì)胞術(shù)分析184例癌癥患者的T淋巴細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞亞群，討論患者的免疫狀態(tài)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 選取桂北地區(qū)（桂林市、賀州市），中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二四醫(yī)院腫瘤科在2017年1月至12月收治腫瘤患者共184例，男性77例，女性107例，年齡區(qū)間在30～70歲，其中94例鼻咽癌，32例乳腺癌，36例宮頸癌，22例肺癌。所有病例均經(jīng)過病理學(xué)明確診斷。同時選取40例健康體檢人員，作為正常對照組，符合性別年齡區(qū)間，排除近期有感染情況和其他疾病。

1.2 方法

1.2.1 材料和試劑 采集腫瘤組和正常組的靜脈外周血2 ml于乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）的抗凝管中，反復(fù)顛倒混合。T淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒、淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒、溶血素、熒光微球計數(shù)試劑（996/μl），試劑盒由美國 Beckman coulter Inc公司提供，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.2 儀器 檢測儀器為Epics XL流式細(xì)胞儀，購自美國Beckman coulter Inc公司。

1.2.3 實驗過程 ⑴移液槍取50 μl外周血,5 μl抗體，振搖混勻,避光,置于 28°C 水浴鍋，15 min；⑵加入溶血素 300 μl,避光,置于 28℃水浴鍋,10 min；⑶檢測T淋巴細(xì)胞亞群上樣管中加入50 μl熒光微球試劑；⑷加入PBS磷酸緩沖液500 μl,上機(jī)，調(diào)取方案,檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析。所有數(shù)據(jù)均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）測試水平為 0.05（Sig雙邊）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對計數(shù) CD3+T細(xì)胞與正常組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）有顯著性差異。正常組和腫瘤組CD4+T細(xì)胞的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。正常組和腫瘤組CD8+T細(xì)胞的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。鼻咽癌的CD4+/CD8+比值低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）.乳腺癌(P=0.634）、宮頸癌（P=0.409）、肺癌（P=0.629）較正常組高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 淋巴細(xì)胞亞群相對計數(shù) 鼻咽癌組和正常組CD3+%（P=0.000），CD56+%（P=0.001）的比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 CD19+%（P=0.067）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 乳腺癌組與正常組對比，CD3+%（P=0.453）、CD56+%（P=0.371）、CD19+%（P=0.573）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與正常組比較，宮頸癌CD3+%（P=0.000）差異有統(tǒng)計學(xué)意義;CD56+%（P=0.094）CD19+%（P=0.235）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肺癌組與正常組對比，CD3+%（P=0.157）、CD56+%（P=0.287）、CD19+%（P=0.177）差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 T淋巴細(xì)胞亞群的絕對細(xì)胞計數(shù)

3 討論

人外周血淋巴細(xì)胞群由三種細(xì)胞組成：T細(xì)胞（來自胸腺），B細(xì)胞（來自骨髓）和NK細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞）在免疫系統(tǒng)的功能中起著核心作用。取決于它們的表型和功能，T細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞測定中的成熟 T細(xì)胞 （CD3+）、 輔助/誘導(dǎo) T細(xì)胞（CD4+）、抑制/細(xì)胞毒 T 細(xì)胞（CD8+）[5]。 用抗原或巨噬細(xì)胞活化T淋巴細(xì)胞后，某些B細(xì)胞（CD19+）分化成產(chǎn)生和分泌特異性免疫球蛋白的漿細(xì)胞。NK細(xì)胞（CD56+）被認(rèn)為是離散的細(xì)胞溶解受體，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生成、保護(hù)機(jī)體免受病毒感染和消除惡性細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用[6]。

表2 淋巴細(xì)胞亞群的相對計數(shù)

CD3+T細(xì)胞可以反映宿主細(xì)胞的免疫狀態(tài)。CD4+T細(xì)胞主要為輔助性淋巴細(xì)胞，具有免疫記憶功能和直接殺傷腫瘤細(xì)胞功能,可分泌多種免疫抑制因子，如IL-2,IL-4,IL-10,IFN-γ等,抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移。本研究中,腫瘤組CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞值低于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與多位學(xué)者報道結(jié)果一致[7-10]。在癌癥患者中，受多種抑制因子的影響，機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，導(dǎo)致抑制CD4+T細(xì)胞的分化和成熟。從而造成CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的免疫功能低下。

CD8+T細(xì)胞可分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），對細(xì)胞具有一定的殺傷作用，可抑制免疫應(yīng)答，對細(xì)胞免疫進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。在本研究中，腫瘤各組的CD8+T細(xì)胞低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CD8+T細(xì)胞價值的變化更為復(fù)雜，學(xué)術(shù)界沒有統(tǒng)一的結(jié)果。李月亞等[3]認(rèn)為肺癌患者CD8+T細(xì)胞比例顯著高于對照組。它表明肺癌免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生更多的CD8+T細(xì)胞并直接殺傷腫瘤細(xì)胞；但有學(xué)者[11]發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血CD8+T細(xì)胞比例下降，肺癌患者CD8+T細(xì)胞表面特異性受體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。效應(yīng)T細(xì)胞識別并結(jié)合靶標(biāo)，反饋會導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞比例下降，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃離，CD8+T細(xì)胞比例下降。鄭惠源等[12]提出，鼻咽癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群治療前CD8+T細(xì)胞水平明顯高于正常對照組。而CD8+T細(xì)胞水平在治療后明顯下降。 梁新強(qiáng)等[13]在乳腺癌研究中，疾病組CD8+T細(xì)胞水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其原因被認(rèn)為是產(chǎn)生腫瘤衍生細(xì)胞因子的惡性腫瘤中惡性細(xì)胞的生長。譚秋梅認(rèn)為[14]，在宮頸癌研究中，CD8+T細(xì)胞的水平顯著高于正常組。在司遠(yuǎn)征的研究中，鼻竇炎患者的免疫功能處于失衡狀態(tài)，細(xì)胞的免疫功能出現(xiàn)損傷，患者的T淋巴細(xì)胞亞群各項結(jié)果均低于健康對照組[15]。

CD4+/CD8+比值是調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的重要部分，以維持免疫應(yīng)答的相對平衡,并且是維持機(jī)體正常細(xì)胞免疫的重要因素。當(dāng)自身免疫性疾病或腫瘤發(fā)生時，CD4+/CD8+比值下降，患者處于免疫抑制狀態(tài)[16]。本研究中鼻咽癌的CD4+/CD8+比值低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。說明鼻咽癌患者細(xì)胞免疫功能降低，機(jī)體免疫功能失調(diào)。在治療之前，CD4+/CD8+比值較低,但在治療后不斷提高，表明患者的免疫功能有不同程度地恢復(fù)[12]。乳腺癌、宮頸癌、肺癌都略微高于正常組，但差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義，患者在臨床治療中是有效的，可以減少免疫抑制因子釋放腫瘤細(xì)胞,因此患者病情有所改善。在于鴻[17]提出的成果中，宮頸癌患者CD4+/CD8+比值與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是隨著患者臨床分型呈降低趨勢。

自然殺傷（NK）細(xì)胞來源于骨髓造血組織，屬于先天免疫系統(tǒng),在人體免疫系統(tǒng)中起著重要作用。NK細(xì)胞的激活不需要抗原呈遞,也不需要MHC限制，獨立于抗體和快速激活[18]。NK細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，短期內(nèi)具有增殖力大、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老等特點，NK細(xì)胞不僅參與抗病毒感染，腫瘤和免疫調(diào)節(jié)，還參與某些情況下自身免疫性疾病的發(fā)生,受到普遍關(guān)注，臨床應(yīng)用也顯示出巨大潛力和廣闊前景[19]。本研究中，鼻咽癌NK細(xì)胞相對計數(shù)（CD56+%）高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），討論可能與誘導(dǎo)鼻咽癌惡性細(xì)胞增殖產(chǎn)生的腫瘤衍生細(xì)胞因子有關(guān)。NK細(xì)胞相對計數(shù)（CD56+%）在乳腺癌中略低于正常組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.371），猜測癌細(xì)胞未轉(zhuǎn)移，對免疫系統(tǒng)影響不大，與孫智[10]做出的結(jié)果相似。宮頸癌和肺癌中NK細(xì)胞相對計數(shù)（CD56+%）略高于正常組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

B細(xì)胞是具有初級體液免疫功能的淋巴細(xì)胞[20]。本研究中，腫瘤組與正常組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。還需要結(jié)合患者藥物療法，免疫療法，輔助療法等進(jìn)行進(jìn)一步研究。章梁君等[21]認(rèn)為，某些腫瘤患者的B細(xì)胞相對計數(shù)（CD19+%）與正常組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有可能說明在體液免疫中B細(xì)胞在惡性腫瘤疾病中影響較小。肺癌病人外周血流式檢測B細(xì)胞表面因子CD19+CD20-，結(jié)果顯示，在肺癌轉(zhuǎn)移患者高于未轉(zhuǎn)移患者，B細(xì)胞高表達(dá)抑制性分子；但是存在歸巢障礙,可能不能到達(dá)刺激淋巴器官，有效啟動體液免疫應(yīng)答[22]。

綜上所述,流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞亞群是幫助診斷患者免疫功能是否正常的重要指標(biāo)，在免疫監(jiān)視、殺傷靶細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)等方面影響力較大。細(xì)胞免疫在腫瘤疾病的發(fā)展和治療中起著重要作用。T淋巴細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞亞群檢測的細(xì)胞因子,在免疫過程中互相促進(jìn)或者抑制,對患者機(jī)體免疫功能的失衡和抗腫瘤免疫起著重要的作用。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測癌癥患的T淋巴細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞亞群，評估患者的狀況，身體免疫情況實時監(jiān)測、后期治療指導(dǎo)用藥具有一定的臨床應(yīng)用價值。