高雅莉，陳亞，李代清

移植后糖尿?。≒TDM）是腎移植患者的常見并發(fā)癥［1］。移植后糖尿病的危險(xiǎn)因素包括年齡、家族史、肥胖、免疫抑制劑的使用等［2］。他克莫司作為免疫抑制劑中的一線用藥［3］，雖能提升患者及移植物的存活率，但同時(shí)也增加了移植后糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Porrini等［4］報(bào)告PTDM的患病率在術(shù)后3、12、24和36個(gè)月分別為27%、21%、21%和30%。如果他克莫司損傷胰島的潛在機(jī)制被闡明，就可以預(yù)防性地對(duì)可能發(fā)生移植后糖尿病的高危患者給予胰島保護(hù)措施，減少移植后糖尿病發(fā)病率。既往報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期、大劑量在動(dòng)物體內(nèi)使用他克莫司，可導(dǎo)致胰腺組織的氧化應(yīng)激、β 細(xì)胞凋亡、胰島素分泌不足，最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生［5-6］。但實(shí)際上臨床中他克莫司使用劑量遠(yuǎn)低于既往報(bào)道劑量（1.5 mg/kg），為進(jìn)一步探索更接近于移植后患者他克莫司使用劑量對(duì)胰島功能的影響，本研究關(guān)注小劑量、短期使用他克莫司對(duì)大鼠血糖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD 大鼠20 只，體質(zhì)量300～350 g，購(gòu)自北京華阜康公司。動(dòng)物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，自由獲取水和食物。他克莫司購(gòu)自MCE公司，用橄欖油稀釋成所需濃度。血糖儀（Accu-Check，Roche Diagnostics）和配套血糖試紙購(gòu)自羅氏公司。大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定試劑盒購(gòu)自Mercodia 公司。Insulin 抗體購(gòu)自Servicebio 公司。通用二步法檢測(cè)試劑盒、DAB染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。蘇木素染液購(gòu)自索萊寶公司。E.Z.N.A.總RNA 分離試劑盒購(gòu)于美國(guó)OMEGA 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；定量PCR試劑盒（FAST SYBR Mixture）購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 在適應(yīng)環(huán)境1周后，將20只大鼠隨機(jī)分成低劑量組、中劑量組、高劑量組、對(duì)照組4組，實(shí)驗(yàn)組分別皮下注射0.1、0.5、1.0 mg/kg他克莫司，每日1次，連續(xù)注射1周，對(duì)照組皮下注射等劑量橄欖油。

1.2.2 體質(zhì)量監(jiān)測(cè) 隔天在同一時(shí)段給動(dòng)物稱質(zhì)量，記錄實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物體質(zhì)量變化情況。

1.2.3 腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT） 動(dòng)物禁食過夜，采取尾尖扎血的方式測(cè)量空腹血糖，然后每只鼠腹腔注射50%葡萄糖（2 g/kg），分別以同種方法測(cè)量30、60、120 min的血糖值。由IPGTT 結(jié)果，采用梯形估算法［7］根據(jù)IPGTT 結(jié)果計(jì)算曲線下面積。

1.2.4 胰島素抵抗情況評(píng)估 在給藥1周后，尾尖取血測(cè)量空腹血糖（FBG），大鼠麻醉后股動(dòng)脈取血，ELISA試劑盒檢測(cè)空腹胰島素（FINS）含量并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型下胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。HOMA-IR=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5。

1.2.5 胰尾部取材 大鼠過夜禁食，麻醉后四肢固定，75%乙醇皮膚消毒，沿正中切口切開，快速剪取胰尾部，置于4%多聚甲醛中固定。48 h 后，組織經(jīng)過不同濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋等步驟后，切片至5 μm備用。

1.2.6 免疫組化染色 用insulin 染色評(píng)估每個(gè)胰島中胰島素陽(yáng)性區(qū)域。經(jīng)過脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化氫消除、血清封閉后，切片用insulin（1∶500）抗體4 ℃過夜孵育，然后滴加增強(qiáng)復(fù)合物和二抗，根據(jù)DAB 染色程度判定胰島素蛋白的表達(dá)情況。在400放大倍數(shù)下每組隨機(jī)觀察15個(gè)胰島，通過測(cè)量胰島素染色陽(yáng)性區(qū)域占總胰島面積的百分比來量化β細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 大鼠胰島的摘取 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg，麻醉后取仰臥位將其四肢固定于手術(shù)臺(tái)上。75%乙醇消毒皮膚后，取正中切口，暴露腹腔臟器。找到膽總管，分別在十二指腸乳頭端及近肝門處予1號(hào)絲線結(jié)扎。股動(dòng)脈放血處死大鼠，于膽總管近肝門處0.45 mm頭皮針穿刺，向胰腺內(nèi)灌注濃度為1 g/L 膠原酶Ⅴ約10 mL，至胰腺完全膨脹，迅速分離胰腺，置于50 mL 離心管中，37 ℃水浴20～25 min 后，預(yù)冷Hank's液約35～40 mL終止消化，用力搖晃離心管，使胰腺組織成泥沙狀，靜置5 min（冰?。浞謱雍髼壣蠈右后w，加入35～40 mL 預(yù)冷Hank's 液，洗滌2 次。混勻后取2～3 mL 消化物于平皿中，體式鏡下手工挑揀胰島，置于裝有Hank's液的1.5 mL EP管中備用。

1.2.8 qPCR檢測(cè)胰島素分泌相關(guān)基因的表達(dá) 將收集的胰島按E.Z.N.A.總RNA分離試劑盒說明書萃取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 5 min，42 ℃1 h，72 ℃5 min。定量PCR試劑盒擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃擴(kuò)增30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40 個(gè)循環(huán)，引物序列見表1。根據(jù)qPCR 得出的熒光曲線的Ct 值，以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果，ΔCt=目的基因Ct 值-β-actin Ct值，ΔΔCt=低劑量組ΔCt值-對(duì)照組ΔCt值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以對(duì)照組的倍數(shù)表示。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR表1 定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。他克莫司不同濃度干預(yù)組與對(duì)照組相比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。組內(nèi)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。小劑量干預(yù)組與對(duì)照組間胰島素分泌相關(guān)基因表達(dá)水平比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組間體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組體質(zhì)量逐漸增加，他克莫司小劑量組體質(zhì)量無明顯變化，中、高劑量組呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，不同劑量他克莫司組均出現(xiàn)體質(zhì)量下降，且呈劑量依賴性。見表2。

2.2 腹腔內(nèi)注射葡萄糖耐量試驗(yàn) IPGTT 結(jié)果顯示，120 min 內(nèi)4 組血糖均呈現(xiàn)先升高后降低的變化，均于30 min達(dá)到峰值。與對(duì)照組相比，不同劑量他克莫司組均出現(xiàn)糖耐量異常，中、高劑量組血糖水平和曲線下面積均較低劑量組升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表3、圖1。

Fig.1 Comparison of the area under the curve of glucose圖1 葡萄糖曲線下面積比較

2.3 胰島素抵抗水平比較 4 組間FBG、FINS 和HOMA-IR差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.4 免疫組化染色結(jié)果 低劑量組與對(duì)照組胰島β細(xì)胞形態(tài)清晰完整，染色面積無明顯變化；中、高劑量組胰島β細(xì)胞排列位置紊亂，內(nèi)部出現(xiàn)空泡，胰島素陽(yáng)性染色面積較低劑量組與對(duì)照組減少（P＜0.05），見圖2。

Tab.2 Changes of the body mass changes during the experiments in the four groups表2 4組實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化 （g，n=5，±s）

Tab.2 Changes of the body mass changes during the experiments in the four groups表2 4組實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化 （g，n=5，±s）

＊＊P＜0.01；同一時(shí)間不同組間比較，a與對(duì)照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.05；組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，A與day 0 比較，B與day 2比較，C與day 4比較，P＜0.05

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組F day 0 331.40±3.71 334.20±4.09 335.40±3.21 337.40±4.67 2.01 day 2 360.40±8.26A 332.80±6.06a 331.00±4.00a 323.40±4.39aA 37.35＊＊day 4 372.40±6.19AB 336.20±6.12a 324.40±5.98abA 310.60±4.67abcAB 104.63＊＊day 6 384.00±8.97ABC 340.00±5.72a 321.40±8.44abAB 299.80±5.54abcABC 119.15＊＊F 50.81＊＊1.86 6.01＊＊56.36＊＊

Tab.3 The results of intraperitoneal glucose tolerance test in the four groups表3 4組腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果 （mmol/L，n=5，±s）

Tab.3 The results of intraperitoneal glucose tolerance test in the four groups表3 4組腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果 （mmol/L，n=5，±s）

＊＊P＜0.01；同一時(shí)間不同組間比較，a與對(duì)照組比較，b與小劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.05；組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，A與0 min 比較，B與30 min比較，C與60 min比較，P＜0.05

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組F 0 min 4.72±0.34 5.00±0.58 4.98±0.54 4.96±0.15 0.45 30 min 20.58±2.11A 23.90±2.04aA 28.16±2.33abA 28.08±1.69abA 15.81＊＊60 min 10.78±1.18AB 17.14±3.45aA 20.24±2.41abAB 23.03±1.34abAB 26.50＊＊120 min 6.08±0.29BC 7.88±1.65BC 11.10±2.53abABC 12.64±1.27abABC 16.41＊＊F 170.72＊＊78.56＊＊115.61＊＊341.84＊＊

Tab.4 Changes in FBG,FINS and HOMA-IR of four groups表4 不同組間FBG、FINS、HOMA-IR變化（n=3，±s）

Tab.4 Changes in FBG,FINS and HOMA-IR of four groups表4 不同組間FBG、FINS、HOMA-IR變化（n=3，±s）

均P＞0.05

組別對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組F FBG（mmol/L）4.50±0.31 5.03±0.50 5.37±0.42 5.17±0.15 2.79 FINS（mIU/L）5.51±1.91 4.59±1.17 4.95±1.29 5.65±1.73 0.30 HOMA-IR 1.10±0.28 1.01±0.15 1.18±0.33 1.29±0.35 0.47

Fig.2 Comparison of the insulin staining results and percentage of insulin positive area between the four groups圖2 4組胰島素染色結(jié)果和胰島素陽(yáng)性面積比較

2.5 胰島素分泌相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果 qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低劑量組Epac、Rim2、Piccolo、Rab3a、Munck13表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

Fig.3 Effects of low dose tacrolimus on gene expression of insulin secretion related protein圖3 小劑量他克莫司對(duì)胰島素分泌相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響

3 討論

以往研究報(bào)道多以長(zhǎng)期大劑量使用他克莫司導(dǎo)致糖耐量異常為主，并未報(bào)道過小劑量短期使用他克莫司也會(huì)出現(xiàn)糖耐量異?，F(xiàn)象。本研究與既往報(bào)道相同的是，高、中劑量組均出現(xiàn)β 細(xì)胞數(shù)量減少，胰島素染色陽(yáng)性面積減少，胰島素合成減少。大劑量他克莫司干預(yù)導(dǎo)致糖耐量異常的機(jī)制早在Heit等［8］的研究中曾報(bào)道，他克莫司通過抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T 細(xì)胞核因子（Cn/NFAT）通路，抑制影響 β 細(xì)胞生長(zhǎng)和胰島素的合成。He 等［9］發(fā)現(xiàn) Cn/NFAT 通路可調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈高壓模型大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡。胰島素由胰腺β 細(xì)胞產(chǎn)生，葡萄糖刺激的胰島素分泌包括兩個(gè)時(shí)相，Epac在一相分泌中占主導(dǎo)作用，PKA 在二相分泌中占主導(dǎo)作用［10］。在高糖刺激條件下，cAMP 可以通過Epac途徑來促進(jìn)胰島素的胞吐［11］。此外，Epac促進(jìn)胰島素分泌可能與其和Rim2-Rab3a 形成的復(fù)合體有關(guān)［12］。Rim2 通過與囊泡相關(guān)蛋白 Rab3a 相互作用的囊泡對(duì)接，以及通過激活下游因子Munc13，導(dǎo)致反式 SNARE 復(fù)合物的組裝，從而導(dǎo)致胞吐［13］。Piccolo 作為胰腺細(xì)胞胞吐作用的鈣離子傳感器，Piccolo與Rim2以鈣離子依賴的方式形成異二聚體，在cAMP誘導(dǎo)的胞吐作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用［14］。

血糖升高主要的原因可歸因于胰島素分泌減少和胰島素抵抗，胰島素分泌減少可由胰島素合成減少和分泌異常導(dǎo)致。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示不同劑量他克莫司組的HOMA-IR 與對(duì)照組無明顯差異，說明在短時(shí)間內(nèi)并未出現(xiàn)胰島素抵抗，所以主要考慮胰島素分泌減少的問題。低劑量組胰島素陽(yáng)性面積與對(duì)照組無明顯差異，說明胰島的合成功能無異常，故主要考慮胰島分泌功能是否異常。摘取低劑量干預(yù)組大鼠胰島做分泌相關(guān)蛋白的PCR 檢測(cè)，結(jié)果表明，胰島素分泌相關(guān)基因Epac、Rim2、Piccolo、Rab3a、Munck13表達(dá)減少，小劑量短期干預(yù)組胰島素合成并無變化，主要通過胰島素分泌障礙來致使胰島素分泌減少、糖耐量異常。

本研究的發(fā)現(xiàn)在低于一般報(bào)道劑量（1.5 mg/kg）15 倍（0.1 mg/kg）的情況下，只需干預(yù)1 周的他克莫司便可造成糖耐量異常，這一發(fā)現(xiàn)超出了我們對(duì)他克莫司造成胰島損傷的一般預(yù)期。他克莫司胰島毒性是目前胰島移植臨床轉(zhuǎn)歸的障礙之一，如果其中的潛在機(jī)制被闡明，可以預(yù)防性地對(duì)可能發(fā)生移植后糖尿病的高?；颊呓o予胰島保護(hù)措施，如GLP-1等，為移植后糖尿病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的降低提供新思路。