闕克華，王瑜，劉潔，劉楊秋，文靜

人成牙本質(zhì)細胞（human odontoblasts，HODs）是牙髓組織中十分特殊且生物學(xué)功能復(fù)雜多樣的細胞，在牙髓防御外界傷害性刺激和組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HODs是潛在的感知外部刺激和牙髓微循環(huán)中瞬態(tài)變化的重要細胞之一［1］。瞬時感受器電位（transient receptor potential，TRP）通道蛋白在人體感受外界各種刺激，包括溫度、酸、滲透壓和機械刺激等方面發(fā)揮重要作用。瞬時感受器電位香草酸受體2（transient receptor potential vanilloid 2，TRPV2）離子通道是TRP亞家族成員之一，在組織中分布廣泛，參與機體感受溫度、滲透壓和機械刺激等多種生理功能［2］。課題組前期實驗已經(jīng)證實TRPV2 在牙髓組織細胞中的表達［3］。但目前對TRPV2 離子通道在人牙髓組織中炎癥相關(guān)的作用機制研究尚較缺乏，特別是炎癥因子對HODs樣細胞TRPV2影響的研究少見報道。有研究報道腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）在早期牙髓炎癥發(fā)展過程中較其他炎癥因子具有更高的檢出率。因此，本研究通過觀察TNF-α 調(diào)控 HODs 樣細胞 TRPV2 離子通道表達水平，進一步探討TRPV2 離子通道在牙髓組織中的機制及生理功能。

1 材料與方法

1.1 樣本選擇 收集2016年9月—2017年1月在天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診因阻生、正畸等原因而預(yù)防性拔除的健康完整第三磨牙共20 顆。患者年齡18～25 歲，無全身系統(tǒng)性疾病，牙髓組織健康，無齲壞、牙周炎和牙髓炎表現(xiàn)。所有實驗用牙齒經(jīng)過患者知情同意，本研究通過了天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會審查（批準號TMUSHh-MEC2014010）。

1.2 主要材料及儀器 小鼠抗人涎磷蛋白（DSPP）單克隆抗體、兔抗人nestin 多克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司；兔抗人TRPV2抗體購自美國Pro Sci公司；胎牛血清購自中國四季青公司；β-甘油磷酸鈉、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、高速離心機均購自美國Sigma 公司；TNF-α 購自美國 Novus Bio；腫瘤壞死因子受體1（TNF receptors 1，TNFR1）拮抗劑R-7050 購自英國 Tocris Bioscience 公司；細胞固定/破膜試劑盒、PCR 電泳儀、FACSCanto Ⅱ均購自美國BD公司；Olympus DP72型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 HODs 樣細胞的培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下劈開牙齒，取出牙髓，剪刀去除根尖端約2 mm部分，用含雙抗的PBS漂洗3 遍。濕潤條件下將牙髓剪碎至0.5～1.0 mm3。加入1.5 mL 培養(yǎng)基，吹打均勻后接種到T25 培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含10%的胎牛血清、2 mmol/L β-甘油磷酸鈉、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和0.25 g/L兩性霉素B的DMEM培養(yǎng)基，置入37 ℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，2～4 d 進行換液。在細胞顯微鏡下觀察，直至組織周圍有呈現(xiàn)成纖維細胞樣形態(tài)的細胞爬出。待細胞長滿后進行傳代，選取第4～6代細胞進行實驗。將細胞接種于60 mm平皿中，用含10%胎牛血清、50 g/L 維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的DMEM 礦化液培養(yǎng)。待出現(xiàn)細胞結(jié)節(jié)后進行von Kossa 染色。另取細胞制成單細胞懸液，接種至12孔板，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，PBS 洗滌3 次，4%多聚甲醛室溫固定15 min。對細胞進行DSPP 和nestin 免疫熒光（immunofluorescence，IF）染色，一抗使用小鼠多克隆抗體DSPP（DSPP∶PBS=1∶200）和nestin（nestin∶PBS=1∶200），二抗使用異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的山羊抗小鼠 IgG（FITC∶PBS=1∶200～1∶400）。陰性對照組使用PBS 替代一抗，其余條件一致。使用Olympus DP72型光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)進行拍照，傳代及誘導(dǎo)通過免疫熒光鑒定成為HODs 樣細胞后凍存，后續(xù)實驗隨用隨取。

1.3.2 IF 染色檢測TRPV2 在HODs 樣細胞中的表達 將細胞接種到載玻片上，室溫下在4%多聚甲醛中固定15 min。用1%Triton X-100 滲透5 min 后，用10%山羊血清在37 ℃封閉非特異性結(jié)合位點2 h。將載玻片滴加一抗兔多克隆抗體TRPV2（稀釋度1∶200），4 ℃下孵育過夜。洗凈后，滴加二抗（山羊多克隆抗鼠IgG-FITC）37 ℃下孵育30 min。細胞核用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚在室溫下復(fù)染8 min，用抗熒光衰減封片劑滴在載玻片上封片，然后通過直立熒光顯微鏡觀察。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測TNF-α對TRPV2 離子通道m(xù)RNA 表達的影響 將細胞分別在含有0、1、10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，按照Trizol試劑使用說明，從細胞中提取總RNA。使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將純化的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在ABI-7500 實時PCR 儀中進行實時定量 PCR 擴增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為管家基因使相對表達水平標準化。使用Opticon Monitor Analysis Software V 2.02（MJ Research）進行分析。TRPV2 引物：上游5'-TAGAGAATGGAGCGAATGTT-3'，下游 5'-TCATACATGTGGATCACCAG-3'，產(chǎn)物大小327 bp。GAPDH 引物：上游5'-GGAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，產(chǎn)物大小226 bp。另取細胞進行TNFR1拮抗劑 R-7050 的相關(guān)實驗，在10 μg/L TNF-α 處理 24 h 前，用 5 μmol/L R-7050 處理細胞 2 h，陰性對照組無 R-7050 處理，再用上述方法進行檢測，每組實驗重復(fù)3次。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）分析 TNF-α 對TRPV2 離子通道蛋白表達的影響 將細胞分別在含有0、1和 10 μg/L TNF-α 的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24 h 后，預(yù)冷 PBS 沖洗細胞，洗凈液體后加入含苯甲基磺酰氟的RIPA 裂解液（RIPA=1∶100，現(xiàn)配現(xiàn)用），加入量為細胞體積的4 倍，使細胞裂解。二喹啉甲酸測定法測定總蛋白質(zhì)濃度。通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后依次用相應(yīng)的一抗和二抗，并用電化學(xué)發(fā)光免疫（ECL）系統(tǒng)成像。另取細胞進行R-7050 的相關(guān)實驗，在10 μg/L TNF-α 處理24 h 前，用 5 μmol/L R-7050 處理細胞2 h，陰性對照組無R-7050處理，再用上述方法進行檢測，每組實驗重復(fù)3次。

1.3.5 流式細胞術(shù)（FCM）檢測TNF-α 對TRPV2離子通道表達的影響 將細胞分別在含有0和10 μg/L TNF-α的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，按照細胞固定/破膜試劑盒說明配制反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)條件。將細胞懸浮液置于Cytofix/Cytoperm 溶液中，于4 ℃孵育20 min，滴加TRPV2 抗體（稀釋度1∶200），4 ℃孵育2 h，滴加 Alexa Fluor 488 標記的針對兔 IgG 的山羊多克隆抗體，使用FACS Canto Ⅱ進行檢測，通過FlowJo 程序分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t法。檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HODs 樣細胞的鑒定 經(jīng)礦化液培養(yǎng)誘導(dǎo)后，肉眼可見白色點狀物，倒置顯微鏡下細胞呈復(fù)層生長，有白色團塊，von Kossa 染色顯示其中央?yún)^(qū)為深褐色，見圖1。通過免疫熒光染色確定DSPP 與nestin 呈陽性表達，且主要位于細胞核和細胞漿，見圖2。確定本實驗分離培養(yǎng)的細胞為HODs樣細胞。

Fig.1 The expression of HODs-like cells induced by mineralization solution圖1 HODs樣細胞經(jīng)礦化液誘導(dǎo)后的表現(xiàn)

Fig.2 The expression of immunofluorescent of cellular DSPP and nestin(×200)圖2 細胞DSPP和nestin免疫熒光染色結(jié)果（×200）

2.2 TRPV2離子通道在HODs樣細胞中的表達 免疫熒光染色結(jié)果顯示，TRPV2 離子通道幾乎在所有細胞呈陽性表達，主要表達于細胞核、細胞漿和細胞膜上，見圖3。

Fig.3 Results of the expression levels of TRPV2 ion channel in HODs-like cells observed by optical microscope(IF staining,×400)圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察TRPV2離子通道在HODs樣細胞中的表達（免疫熒光染色，×400）

2.3 TNF-α 影響TRPV2 離子通道表達水平 RT-qPCR 和 WB 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μg/L TNF-α 對 TRPV2 通道的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達無明顯影響（P＞0.05），而10 μg/L TNF-α 可導(dǎo)致TRPV2通道的mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖4。

Fig.4 Effects of TNF-α with different concentrations on the expression of HODs-like cells圖4 不同濃度TNF-α處理對HODs樣細胞的影響

2.4 TNF-α 對 HODs 樣細胞中 TRPV2 通道蛋白的作用 與對照組（18.7%）相比，加入TNF-α 處理24 h后，TRPV2通道陽性染色細胞數(shù)目（69.4%）顯著增加，見圖5。

Fig.5 Results of flow cytometry for the effect of TNF-α on the expression of TRPV2 ion channel圖5 流式細胞術(shù)檢測TNF-α對TRPV2離子通道表達的影響

2.5 TNFRs 在 TNF-α 調(diào)控TRPV2通道中的作用 RT-qPCR和WB測定結(jié)果顯示，10 μg/L TNF-α可明顯上調(diào)TRPV2 通道的mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平，而這種上調(diào)作用可以被R-7050抑制。甚至在使用R-7050后，TRPV2通道的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平低于對照組（P＜0.05），見圖6。

Fig.6 Gene and protein expressions of TRPV2 channel in HODs-like cells treated with TNF-α圖6 TNF-α處理HODs樣細胞TRPV2通道的基因和蛋白質(zhì)表達

3 討論

3.1 TRPV2 離子通道的作用及存在部位 TRPV2離子通道是TRPV 亞家族成員之一，也是人體重要的感受器之一，可被較高的熱刺激激活（＞52 ℃），提示其可能作為一種高閾值熱傷害性感受體存在［4］。最近有研究報道，TRPV2 離子通道還可以感受低滲透壓、機械刺激以及化學(xué)刺激等［5-6］。TRPV2離子通道在組織中分布廣泛，主要在感覺神經(jīng)元中表達，也存在于血管平滑肌、脾、胰腺等其他組織。目前研究認為其在不同組織細胞中可能發(fā)揮不同的作用，特別是與疼痛和免疫反應(yīng)密切相關(guān)。由于HODs的極性細胞突起緊密嵌入牙本質(zhì)小管中，很難從牙髓中分離出完整的、生物活性高的HODs，而HODs 屬于高度特異的終末分化細胞，常規(guī)體外條件下尚無法進行培養(yǎng)增殖。因此誘導(dǎo)牙髓干細胞形成的HODs樣細胞被廣泛用于代替正常HODs 細胞用于科研。本研究通過誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人牙髓組織細胞，獲得在形態(tài)和功能上與體內(nèi)HODs相似的HODs樣細胞，且表達HODs 相關(guān)的特異性蛋白，如DSPP 和nestin等。同時，在礦化液的誘導(dǎo)下，細胞呈復(fù)層生長并可形成礦化結(jié)節(jié)，進一步證實該細胞具有形成牙本質(zhì)的能力［7］，這也是目前研究HODs樣細胞常用的方法。

3.2 不同濃度TNF-α 對TRPV2 通道基因和蛋白質(zhì)表達水平的影響 研究顯示，在深齲近髓的牙本質(zhì)中或中早期牙髓炎癥的牙髓中TNF-α 檢出率很高［8］。因此本研究采用TNF-α作為刺激因子作用于TRPV2蛋白，且選擇了1 μg/L和10 μg/L 2個不同濃度代表不同的炎癥程度，從而用來推測TRPV2蛋白在炎癥相關(guān)牙體牙髓疾病中可能的功能。本研究首先通過免疫熒光染色證實TRPV2 蛋白在建立的HODs樣細胞模型中表達，繼而用3種分子生物學(xué)方法從不同角度進一步證實TNF-α 能夠明顯上調(diào)HODs 樣細胞中TRPV2 通道m(xù)RNA 和蛋白表達水平。通過RT-qPCR 和WB 對比不使用和分別使用低、高濃度的TNF-α 時TRPV2通道基因和蛋白質(zhì)的表達水平變化，結(jié)果證實高濃度TNF-α能夠明顯上調(diào)HODs樣細胞中TRPV2通道的基因和蛋白表達水平，而低濃度TNF-α對TRPV2通道基因和蛋白質(zhì)的表達無明顯影響。流式細胞術(shù)結(jié)果也充分表明，TNF-α 處理后TRPV2 通道蛋白陽性表達的細胞數(shù)量明顯增多，亦證明了TNF-α對TRPV2通道蛋白表達的增強作用。以上實驗結(jié)果提示，在一些牙體組織或牙髓疾病，如深齲或早期牙髓炎癥中TRPV2通道表達可能會明顯上調(diào)，從而介導(dǎo)HODs 對外界反應(yīng)增強。而TRPV2通道對低、高濃度TNF-α表現(xiàn)的不同反應(yīng)可解釋為TRPV2 通道的活性可能與炎癥程度有關(guān)，炎癥程度越重，TRPV2 通道的活性越高，對外界刺激的反應(yīng)越強。這一點與臨床癥狀也相符合，即在深齲或可復(fù)性牙髓炎情況下，牙髓組織對外界的溫度或機械等刺激的反應(yīng)明顯增強，導(dǎo)致疼痛難以忍受，本研究結(jié)果表明，TRPV2可能參與了這一復(fù)雜過程。

3.3 R-7050 對TRPV2 通道基因和蛋白表達的影響 TNF-α 主要通過細胞膜上的多種TNFRs 發(fā)揮生物效應(yīng)［9］。TNF-α與細胞表面的TNFRs結(jié)合進而激活下游信號通路，表現(xiàn)特異性促炎反應(yīng)，其中最常見的是TNFR1和TNFR2。R-7050是TNFR1信號傳導(dǎo)的特異性抑制劑，不影響TNF-α與TNFR結(jié)合，而是通過阻斷TNFR1 與細胞內(nèi)銜接分子的結(jié)合從而抑制TNF-α 激活MAPK 信號通路。本研究中，RT-qPCR 和 WB 均顯示 R-7050 明顯抑制了 TNF-α 對TRPV2通道基因和蛋白表達的上調(diào)，表明TNFR1可能在該過程中起主導(dǎo)作用。然而，在加入R-7050后，TRPV2 通道基因和蛋白質(zhì)表達水平卻低于不使用R-7050 的對照組，具體原因仍不明確，我們推測R-7050可能通過與TNFR無關(guān)的脫靶效應(yīng)而發(fā)揮某些保護作用［10］。

綜上所述，TNF-α 作為在深齲和早期牙髓炎癥組織中常見的炎癥因子，在牙髓組織炎癥發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用，本研究結(jié)果顯示其能夠明顯上調(diào)成HODs 樣細胞中TRPV2 離子通道表達水平，提示TNF-α可能通過調(diào)控類似TRPV通道表達水平來改變牙髓組織對外界刺激反應(yīng)程度，從而有助于更深入地了解牙髓疼痛感覺傳導(dǎo)機制。