郭亞萍，陳璐瑤，吳紫璇，張翟軼，鄭紡，彭雁飛

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統(tǒng)的常見(jiàn)惡性腫瘤。根據(jù)2018年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，前列腺癌在男性中的發(fā)病率僅次于肺癌，排名第二（13.5%），同時(shí)也是男性第五大致死惡性腫瘤（6.7%）［1］。隨著人口老齡化和生活方式的西方化，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢(shì)［2］。因此尋找和開(kāi)發(fā)治療前列腺癌的有效藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

人參皂苷Rg3是從傳統(tǒng)中藥人參中提取的活性單體成分。文獻(xiàn)報(bào)道，人參皂苷Rg3 具有顯著的抗癌活性［3］。以人參皂苷Rg3為單一成份的藥物參一膠囊已應(yīng)用于肺癌和肝癌等的化療輔助治療。體外研究顯示，人參皂苷Rg3 能夠抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP 和 PC3 的增殖及 PC-3M 細(xì)胞的遷移，并增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物多西他賽的敏感性［4］。然而，其對(duì)前列腺癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制仍未完全清楚。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，25、50和100 μmol/L的人參皂苷Rg3均能夠通過(guò)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PC3中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加來(lái)抑制細(xì)胞增殖［5］。本研究比較了100 μmol/L人參皂苷Rg3 對(duì)PC3 和DU145 細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，并且通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性ROS 水平、線(xiàn)粒體膜電位變化和抗氧化蛋白的表達(dá)，探討其差異調(diào)節(jié)PC3 和DU145細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人前列腺癌細(xì)胞系PC3 和DU145 購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC）；人參皂苷Rg3 購(gòu)自天津賽智維科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自南美Lonsera Science SRL 公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司；DCFH-DA 熒光探針試劑盒、JC-1 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超純RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑PMSF購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；一抗谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-1（GPX-1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、β-actin、羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡公司，型號(hào)IX2-UCB-2）；流式細(xì)胞儀（法國(guó)Millipore公司，型號(hào)ABC250-22INT）；凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)Gl-1）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞系PC3 和DU145 培養(yǎng)于含10%FBS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)液，置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每2～3 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～90%時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將體外培養(yǎng)的PC3 和DU145細(xì)胞接種在24孔板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞過(guò)夜貼壁后，分別使用100 μmol/L 人參皂苷Rg3 和對(duì)照試劑DMSO處理細(xì)胞0、24、48和72 h。使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，于檢測(cè)前在每孔細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10%CCK-8檢測(cè)試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，測(cè)量每孔培養(yǎng)液在波長(zhǎng)450 nm的光密度（OD），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 DCFH-DA活性氧熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平 前期結(jié)果已表明25、50和100 μmol/L的人參皂苷Rg3能夠增加PC3 細(xì)胞ROS 的水平［5］，本研究 將 DU145 細(xì)胞按照 5×104/孔的密度種植在24 孔板中，待過(guò)夜培養(yǎng)貼壁后，分別用DMSO和不同濃度人參皂苷Rg3（25、50 和100 μmol/L）處理72 h。使用DCFH-DA 熒光探針試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平變化，將DCFH-DA 探針用RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋至10 μmol/L，37 ℃處理DU145細(xì)胞20 min，隨后用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 JC-1 法檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位 將PC3 和DU145 細(xì)胞種植在 12 孔板中，分別用 DMSO 和 100 μmol/L 人參皂苷Rg3 處理24 h，按照說(shuō)明書(shū)的要求，使用JC-1 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PC3 和DU145 細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的去極化情況，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞紅綠熒光的強(qiáng)度變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞抗氧化蛋白的表達(dá) 體外培養(yǎng)DU145和PC3細(xì)胞，使用超純RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。使用HiFi-Script cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。隨后，使用Ultra SYBR Mixture對(duì)反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 15 s，共 30 個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）基因作為內(nèi)參，所用引物序列見(jiàn)表1。使用1%濃度的瓊脂糖凝膠分離RT-PCR產(chǎn)物，在凝膠成像儀下觀(guān)察拍照。

Tab.1 Primer sequence for RT-PCR表1 RT-PCR所用引物序列

1.2.6 Western blot 檢測(cè)GPX-1 和SOD2 蛋白表達(dá)情況 使用RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF 提取PC3 和DU145 細(xì)胞總蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，取15 μg 總蛋白加入到12%SDS-PAGE 凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)，常規(guī)電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋后的一抗（GPX-1 1∶300，SOD2 1∶500，β-actin 1∶8 000）后于 4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜6 次后加入稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜6 次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以β-actin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量資料方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3 對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用 結(jié)果表明，100 μmol/L 人參皂苷Rg3 處理細(xì)胞24、48和72 h后，PC3細(xì)胞的增殖被明顯抑制（F分組=78.919、F時(shí)間=801.935、F交互=20.068，均P＜0.001），見(jiàn)圖1A；與對(duì)照組相比，DU145 的增殖不受人參皂苷Rg3的影響（F分組=0.007、P=0.936，F(xiàn)時(shí)間=101.145、P＜0.001，F(xiàn)交互=0.244、P=0.660），見(jiàn)圖1B。

Fig.1 CCK-8 assay for the effects of ginsenoside Rg3 on the proliferation of PC3 and DU145 cells圖1 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人參皂苷Rg3對(duì)PC3和DU145細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用

2.2 人參皂苷Rg3 上調(diào)DU145 細(xì)胞中ROS 的水平結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，25、50 和100 μmol/L 的人參皂苷Rg3 均能上調(diào)DU145 細(xì)胞中ROS 的水平，見(jiàn)圖2。

Fig.2 Ginsenoside Rg3 up-regulated the ROS levels in DU145 cells(×100)圖2 人參皂苷Rg3上調(diào)DU145細(xì)胞中ROS的水平（×100）

2.3 人參皂苷Rg3 誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位去極化 結(jié)果顯示，人參皂苷Rg3 可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的去極化。其中，PC3 細(xì)胞紅綠熒光的比值從對(duì)照組的1.03±0.28 下降到人參皂苷Rg3 處理組的0.34±0.04（n=4，t=4.251，P=0.022），見(jiàn)圖3。DU145 細(xì)胞紅綠熒光的比值從對(duì)照組的6.65±1.74 下降到人參皂苷 Rg3 處理組的 1.18±0.07（n=4，t=5.427，P=0.012），見(jiàn)圖4。

Fig.3 Ginsenoside Rg3 induced mitochondria membrane potential changes in PC3 cells圖3 人參皂苷Rg3誘導(dǎo)PC3細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位極化改變

Fig.4 Ginsenoside Rg3 induced mitochondria membrane potential changes in DU145 cells圖4 人參皂苷Rg3誘導(dǎo)DU145細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位極化改變

2.4 DU145 和PC3 細(xì)胞抗氧化蛋白的表達(dá)水平差異 結(jié)果顯示，GPX-1（n=3，t=5.115，P=0.034）和SOD2（n=3，t=3.283，P=0.030）在DU145 中的表達(dá)顯著高于PC3細(xì)胞，其他蛋白（GPX-1、GPX-3、NQO1、SOD1、SEPP1、NRF2）表達(dá)水平在兩種細(xì)胞中并未檢測(cè)出顯著差異，見(jiàn)圖5A、C。進(jìn)一步通過(guò)免疫印跡法證明，DU145 中 GPX-1（n=3，t=4.692，P=0.009）和SOD2（n=3，t=5.916，P=0.004）的蛋白表達(dá)也顯著高于PC3細(xì)胞，見(jiàn)圖5B、D。

3 討論

3.1 藥物誘導(dǎo)內(nèi)源性ROS 增加可能是抑制癌細(xì)胞的有效策略之一 高水平的ROS可以通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝和信號(hào)通路起到殺傷癌細(xì)胞的作用。通過(guò)藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力抑制癌細(xì)胞增殖或促進(jìn)其凋亡是癌癥治療的一種新的策略。Choi等［6］報(bào)道了利用殼聚糖-巖藻多糖納米顆粒裝載的促氧化藥物Piperlongumine 通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生殺死前列腺癌細(xì)胞。Zhang 等［7］報(bào)道了裝載有丹參抗癌成分的銀納米顆粒能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞系LNCaP 的凋亡。Elkady［8］研究顯示，閉鞘姜提取物（C.speciosus）也能夠通過(guò)增加PC3細(xì)胞內(nèi)ROS 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3 能夠有效抑制PC3 細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，其抑制PC3細(xì)胞的增殖是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性ROS 增加而實(shí)現(xiàn)的［5］。

Fig.5 RT-PCR and Western blot assays for the different expressions of antioxidants in DU145 and PC3 cells圖5 RT-PCR和免疫印跡法比較DU145和PC3細(xì)胞中抗氧化蛋白的表達(dá)

3.2 不同類(lèi)型癌細(xì)胞對(duì)人參皂苷Rg3 可產(chǎn)生差異性應(yīng)答 相同濃度的人參皂苷Rg3在PC3和DU145細(xì)胞中表現(xiàn)出不盡相同的調(diào)節(jié)效應(yīng)。在DU145細(xì)胞中，盡管人參皂苷Rg3 能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性ROS 水平，誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電位去極化，但對(duì)于細(xì)胞增殖的抑制卻并不顯著。早在2014年，Jayakumar等［9］報(bào)道了這2 種細(xì)胞對(duì)電離輻射的應(yīng)答差異，發(fā)現(xiàn)DU145 細(xì)胞對(duì)電離輻射有更強(qiáng)的抵抗性，這是由于PC3 細(xì)胞中具有較高的ROS 水平，同時(shí)谷胱甘肽（GSH）含量以及NF-E2相關(guān)因子-2（NRF2）的表達(dá)水平較低，因此對(duì)氧化損傷的抵抗性更差。Nogueira 等［10］從信號(hào)通路的角度對(duì)此進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸磷酸酶基因（PTEN）缺失的癌細(xì)胞與帶有野生型PTEN的癌細(xì)胞相比Akt 高度激活，其細(xì)胞內(nèi)ROS 水平較高。在2種細(xì)胞系中，DU145表達(dá)野生型的PTEN，而PC3則是 PTEN 缺失的［11］。細(xì)胞內(nèi)高 ROS 水平可能使PC3 細(xì)胞對(duì)ROS 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更加敏感，提示PTEN-Akt 信號(hào)通路的差異導(dǎo)致了不同前列腺癌細(xì)胞對(duì)氧化壓力的耐受能力不同。本研究也比較了2種細(xì)胞系抗氧化蛋白的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與PC3 細(xì)胞相比，DU145細(xì)胞高表達(dá)GPX-1和SOD2基因，這有可能導(dǎo)致DU145和PC3細(xì)胞對(duì)人參皂苷Rg3的差異應(yīng)答。綜上所述，不同的前列腺癌細(xì)胞對(duì)人參皂苷Rg3 的敏感度不同，在應(yīng)用其治療前列腺癌時(shí)可能需要根據(jù)不同抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行預(yù)先篩選。

3.3 人參皂苷Rg3 還可以靶向腫瘤微環(huán)境抑制癌細(xì)胞 研究表明，腫瘤微環(huán)境在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和免疫逃逸等行為；因此，腫瘤微環(huán)境可能是未來(lái)治療前列腺癌的重要靶標(biāo)［12］。研究表明，人參皂苷Rg3 能夠?qū)η傲邢侔┪h(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞的衰老，改變間質(zhì)細(xì)胞旁分泌，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的遷移［13］。由此可見(jiàn)，人參皂苷Rg3 既能作用于癌細(xì)胞本身，也能作用于腫瘤微環(huán)境，從而通過(guò)多種途徑和機(jī)制干預(yù)前列腺癌細(xì)胞的行為，但還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。