朱金鳳，許永劼，朱麗英，代龍光，錢雯，張競之，許雯，李興,2△，潘衛(wèi)，3△

糖尿病腦病是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，以神經(jīng)元損傷引起的認(rèn)知功能障礙為主要特征［1］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全闡明。腦血管神經(jīng)病變、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等均與糖尿病認(rèn)知障礙機(jī)制有關(guān)［2］。認(rèn)知功能障礙的危害性和嚴(yán)重性受到越來越多的關(guān)注，有研究表明，一些神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等均與神經(jīng)元發(fā)生過早、細(xì)胞凋亡過度有關(guān)［3］。目前常用高糖誘導(dǎo)細(xì)胞建立糖尿病腦病模型，主要有原代細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、大腦皮層細(xì)胞、基因工程細(xì)胞等，但細(xì)胞培養(yǎng)成本較高，不易獲得且周期較長。HT-22 細(xì)胞是一種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞，具有生長穩(wěn)定，易獲得的特點(diǎn)。本研究以HT-22細(xì)胞為研究對(duì)象，體外模擬高血糖環(huán)境，觀察不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞生長和凋亡的影響，從而為進(jìn)一步從細(xì)胞水平探討糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞購于中喬新舟公司；葡萄糖購于天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；CCK-8 試劑盒購于日本同仁；二甲基亞砜（DMSO）購于索萊寶公司；0.25%胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液購于美國Gibco公司；胎牛血清購于以色列BI公司；青霉素及鏈霉素購于Hyclone公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；兔源Bcl-2 多克隆抗體購于碧云天生物技術(shù)研究所；兔源βactin 多克隆抗體、兔源Bax 多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體均購于武漢三鷹公司。CO2培養(yǎng)箱購于日本SANYO公司；倒置相差顯微鏡購于日本Nikon公司；Western Blot電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及凍存 HT-22 細(xì)胞正常生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中，隔天傳代，傳代比例為1∶3。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，無菌37 ℃磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3 次，取1 mL的0.25%胰蛋白酶顯微鏡下消化15 s左右，用DMEM 培養(yǎng)液終止消化、吹打混勻、重懸，采用低速離心機(jī)800 r/min，離心5 min，棄上清液，加入現(xiàn)配的凍存液（DMSO∶FBS=1∶9）吹打混勻后，分裝于凍存管中，標(biāo)明細(xì)胞代數(shù)、種類、日期及凍存者。置于梯度凍存盒中12 h 以上后存放于液氮罐中長期保存。

1.2.2 CCK-8 法檢測不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長期的HT-22 細(xì)胞，經(jīng)消化、吹打、離心后，以4×104/mL 的密度均勻接種于96 孔板中，每組細(xì)胞平行設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞生長穩(wěn)定，用含不同濃度的高糖培養(yǎng)液（25、35、45、55、65、75 mmol/L）分別作用于細(xì)胞24、48、72 h，其中以25 mmol/L糖濃度為對(duì)照組，其余為實(shí)驗(yàn)組，另設(shè)沒有細(xì)胞的空白組。處理結(jié)束后每孔加10 μL 的CCK-8 試劑，37 ℃溫箱孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處讀取各組細(xì)胞光密度（OD）值。細(xì)胞活力計(jì)算公式=（實(shí)驗(yàn)組OD 均值-空白組OD 均值）/（對(duì)照組OD均值-空白組OD均值）×100%。

1.2.3 LDH 試劑盒檢測不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞LDH釋放率的影響 將細(xì)胞以4×104/mL的密度均勻接種于96孔板中，其中設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測試孔、對(duì)照孔。每組細(xì)胞平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，待細(xì)胞生長穩(wěn)定，將培養(yǎng)液分別更換為不同濃度葡萄糖（同1.2.2），細(xì)胞處理48 h后，取每孔細(xì)胞上清液20 μL置于96孔板中，嚴(yán)格按照LDH 試劑盒說明書操作進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處讀取各組細(xì)胞OD值。

1.2.4 光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度葡萄糖作用HT-22 細(xì)胞形態(tài)的變化 將細(xì)胞以6×104/mL的密度均勻鋪板于6孔板中，待細(xì)胞生長至60%左右時(shí)，將培養(yǎng)液分別更換為不同濃度葡萄糖（同1.2.2），細(xì)胞處理48 h 后，采用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞凋亡的影響 將細(xì)胞以6×104/mL的密度均勻鋪板于6孔板中，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，待細(xì)胞生長穩(wěn)定，將培養(yǎng)液分別更換為不同濃度葡萄糖（同1.2.2），細(xì)胞處理48 h后，棄去培養(yǎng)液，37 ℃無菌PBS清洗3次，加入0.125%不含EDTA 的胰蛋白酶顯微鏡下消化5～10 min，加入適量DMEM 培養(yǎng)液終止消化。采用低速離心機(jī)1 000 r/min，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，按照說明書操作進(jìn)行，加入500 μL的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，按要求依次加入5 μL 的Annexin V-FITC 和 5 μL 的 Propidium Iodide 充分混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 蛋白印跡法檢測不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將各組細(xì)胞培養(yǎng)后，棄上清，37 ℃無菌PBS 清洗3 次后，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，置于4 ℃低溫高速離心機(jī)12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。以30 μg 蛋白質(zhì)溶液為總上樣量，取適量體積的5×SDS 上樣緩沖液充分混勻，100 ℃變性10 min，經(jīng)12%SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm 的PVDF 膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃搖床孵育一抗βactin（1∶10 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶10 000）過夜。TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min，室溫下孵育帶有HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1∶20 000）二抗2 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，每次10 min。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，細(xì)胞存活率均數(shù)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖對(duì)細(xì)胞活力的影響 不同濃度的高糖分別處理HT-22 細(xì)胞24、48、72 h 后，結(jié)果顯示以劑量依賴（F=53.836，P＜0.01）和時(shí)間依賴（F=15.211，P＜0.01）降低細(xì)胞活力，并且兩者具有交互作用（F=12.512，P＜0.01）。48 h 后，55 mmol/L和65 mmol/L 濃度組細(xì)胞活力為80%左右，見表1。根據(jù)美國藥典細(xì)胞毒性分級(jí)，當(dāng)細(xì)胞活力≥80%時(shí)屬于1 級(jí)細(xì)胞，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。后續(xù)研究將48 h 確定為最適作用時(shí)間。

Tab.1 The effects of different concentrations of glucose and different treatment time on the viability of HT-22 cells表1 不同濃度葡萄糖處理不同時(shí)間對(duì)HT-22細(xì)胞活力的影響 （n=5，%，±s）

Tab.1 The effects of different concentrations of glucose and different treatment time on the viability of HT-22 cells表1 不同濃度葡萄糖處理不同時(shí)間對(duì)HT-22細(xì)胞活力的影響 （n=5，%，±s）

＊＊P＜0.01；a 與 35 mmol/L 組比較，b 與 45 mmol/L 組比較，c 與 55 mmol/L組比較，d與65 mmol/L組比較，P＜0.05

組別35 mmol/L組45 mmol/L組55 mmol/L組65 mmol/L組75 mmol/L組F 24 h 95.21±4.41 92.62±6.66 89.47±5.59 86.46±8.16a 73.79±6.29abcd 8.639＊＊48 h 93.84±2.57 93.61±3.80 82.42±7.37ab 80.78±4.35ab 72.42±3.53abcd 19.515＊＊72 h 79.10±6.27 69.24±4.45a 68.02±5.77a 63.64±5.51a 54.89±2.59abcd 14.961＊＊

2.2 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞LDH 釋放率的影響 不同濃度葡萄糖作用48 h 后，隨著糖濃度的增加，HT-22 細(xì)胞LDH 釋放率逐漸增加（P＜0.05），見表2。

2.3 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞形態(tài)變化的影響 不同濃度葡萄糖作用HT-22 細(xì)胞48 h 后，倒置相差顯微鏡下可見對(duì)照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞密度大，呈梭形和不規(guī)則形，突觸交織成致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有分支，樹突較粗，核仁輪廓隱約可見。其他各實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目減少，胞體變大，部分胞核溶解，突觸斷裂，細(xì)胞碎片等現(xiàn)象，其中以55、65、75 mmol/L變化較為明顯。見圖1。

2.4 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同濃度葡萄糖作用HT-22細(xì)胞48 h后，葡萄糖濃度越高，細(xì)胞凋亡情況越嚴(yán)重（P＜0.05）。見圖2，表2。

2.5 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，不同濃度葡萄糖作用 HT-22 細(xì)胞 48 h 后，55、65、75 mmol/L 組Bax蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，而Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。見圖3，表3。

Tab.2 The effects of different concentrations of glucose on LDH release rate and apoptosis rate of HT-22 cells表2 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞LDH釋放率及凋亡率的影響 （±s）

Tab.2 The effects of different concentrations of glucose on LDH release rate and apoptosis rate of HT-22 cells表2 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞LDH釋放率及凋亡率的影響 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與35 mmol/L 組比較，c與45 mmol/L組比較，d與55 mmol/L組比較，e與65 mmol/L組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組35 mmol/L組45 mmol/L組55 mmol/L組65 mmol/L組75 mmol/L組F LDH釋放率（OD值，n=5）0.315±0.015 0.312±0.011 0.336±0.004 0.341±0.017ab 0.402±0.019abcd 0.455±0.012abcde 48.132＊＊凋亡率（%，n=3）4.88±0.51 6.10±0.49 11.95±1.19ab 15.75±0.57abc 24.68±0.72abcd 30.31±2.10abcde 257.61＊＊

Fig.1 The effects of different concentrations of glucose on the morphology of HT-22 cells(×200)圖1 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

Fig.2 The changes of apoptosis rate of HT-22 cells treated with different concentrations of glucose圖2 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞凋亡率的影響

Fig.3 The changes of protein levels of Bax and Bcl-2 of HT-22 cells treated with different concentrations of glucose圖3 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

Tab.3 Comparison of different concentrations of glucose on the expressions of Bax and Bcl-2 in HT-22 cells表3 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)情況的比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of different concentrations of glucose on the expressions of Bax and Bcl-2 in HT-22 cells表3 不同濃度葡萄糖對(duì)HT-22細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)情況的比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01;a與對(duì)照組比較，b與35 mmol/L 組比較，c與45 mmol/L組比較，d與55 mmol/L組比較，e與65 mmol/L組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組35 mmol/L組45 mmol/L組55 mmol/L組65 mmol/L組75 mmol/L組F Bax 0.183±0.011 0.159±0.018 0.221±0.022b 0.257±0.007ab 0.441±0.037abcd 0.462±0.039abcd 78.832＊＊Bcl-2 0.846±0.053 0.874±0.040 0.839±0.041 0.731±0.019abc 0.728±0.008abc 0.591±0.034abcde 26.156＊＊

3 討論

糖尿病腦病作為糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，認(rèn)知功能障礙是其主要表現(xiàn)特征［4］。研究表明，高血糖是糖尿病認(rèn)知功能障礙的重要原因之一，認(rèn)知功能損害的嚴(yán)重程度與血糖控制水平的高低有直接關(guān)系［5］。正常濃度的葡萄糖可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，然而高濃度的葡萄糖可損害細(xì)胞功能并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［6-7］。細(xì)胞凋亡是引起糖尿病腦神經(jīng)病變的一種重要方式，腦細(xì)胞凋亡在糖尿病性腦神經(jīng)病變病理過程中起重要的作用，已有研究表明高糖對(duì)多種細(xì)胞或動(dòng)物模型具有誘導(dǎo)細(xì)胞衰老與凋亡的作用。本研究以小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT-22細(xì)胞為對(duì)象，研究不同濃度葡萄糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

Keats 等［8］發(fā)現(xiàn)高血糖水平可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制并且可改變分化潛能。另有研究表明高糖可誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，其中包括細(xì)胞活力降低及凋亡率增高［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖對(duì)HT-22 細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，并且具有濃度依賴性，葡萄糖濃度越高，抑制細(xì)胞活性作用越強(qiáng)。參照課題組前期對(duì)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)的研究［10］，本研究設(shè)置了相應(yīng)的糖濃度，不同濃度葡萄糖分別作用HT-22細(xì)胞48 h，細(xì)胞活力顯著下降，且LDH 釋放率顯著上升，大部分細(xì)胞活力在80%以上。因此，本研究將高糖濃度作用最佳時(shí)間確定為48 h，這為后續(xù)細(xì)胞損傷模型的建立奠定了基礎(chǔ)。Dludla等［11］和梁家亮等［12］發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡；侯佳等［13］發(fā)現(xiàn)高糖濃度在40、50 mmol/L時(shí)能顯著誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果顯示在高糖環(huán)境下，隨著糖濃度增高，HT-22細(xì)胞凋亡率明顯增高，由此可見，高糖導(dǎo)致HT-22細(xì)胞凋亡可能是引起糖尿病腦病的一個(gè)重要因素。

越來越多的研究表明細(xì)胞凋亡在糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主有序性的死亡，其中涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等過程。其中，Bcl-2 家族在各刺激信號(hào)引起的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，是目前研究細(xì)胞凋亡機(jī)制較為常見和成熟的途徑之一，在調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路中起著關(guān)鍵作用，其家族包括以Bax 為代表的促凋亡因子和以Bcl-2 為代表的抗凋亡因子。當(dāng)Bax 過度表達(dá)，Bax 與Bcl-2異源二聚體解離，形成Bax-Bax的同源二聚體，從而加速細(xì)胞凋亡，減弱Bcl-2 對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。由此可以看出，促進(jìn)凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白的比值共同決定了細(xì)胞的命運(yùn)［14］。有研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可減輕高糖對(duì)人心肌細(xì)胞株凋亡情況，可使Bax 表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的增高，細(xì)胞凋亡率也明顯增高，此結(jié)果與楊璐等［16］的研究結(jié)果一致，并且本研究將高糖濃度范圍更加細(xì)化，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高糖濃度在55、65、75 mmol/L 作用細(xì)胞時(shí)，凋亡相關(guān)蛋白Bax 表達(dá)增加，Bcl-2 表達(dá)下降。由此可以證明高糖可通過調(diào)節(jié)Bax 和Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)HT-22細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，高糖可通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡而抑制HT-22細(xì)胞生長，且隨著糖濃度的升高，凋亡率也顯著上升，具有濃度依賴性。今后將繼續(xù)更加深入研究糖尿病腦病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為糖尿病腦病防治提供思路和方向。