(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)為一年生具塊莖的糧、菜、飼兼用作物[1-2]。內(nèi)蒙古是我國(guó)種薯與商品薯的重要生產(chǎn)基地，年種植面積約68萬hm2。隨著我國(guó)北方鐮刀灣地區(qū)玉米種植面積調(diào)減計(jì)劃的實(shí)施，馬鈴薯種植面積將呈增加趨勢(shì)[3-4]。然而，目前優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的馬鈴薯新品種短缺已成為限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素[5-6]，亟待研發(fā)適合內(nèi)蒙古地區(qū)種植的馬鈴薯優(yōu)良新品種。

在廣泛收集、評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)外馬鈴薯種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，開展了馬鈴薯雜交育種研究工作，選育出10個(gè)有重要栽培利用價(jià)值的馬鈴薯雜交新品系NNCS-38、NNCS-46、NNCS-02、NNS-MB 9、NNS-B 12、NNS-WD 35、NNS-07、NNS-A 1、NNS-A 6和NNS-A 10。為了明確這10個(gè)新品系在DNA水平上的遺傳差異性，對(duì)下一步新品種的登記和保護(hù)利用提供分子依據(jù)，本試驗(yàn)擬利用成熟的SRAP(Sequence related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)[7]分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 材料及種植方式

材料為本課題組雜交育成的10個(gè)馬鈴薯品系NNCS-38(Red-P 1×黑美人F1株系38)、NNCS-46(Red-P 1×黑美人F1株系46)、NNCS-02(MIN-021×黑美人F1株系02)、NNS-MB 9(MB×027 F1株系09)、NNS-B 12(H-027×隴薯7號(hào)F1株系12)、NNS-WD 35(1867×隴薯7號(hào)F1株系14)、NNS-07(大西洋×隴薯6號(hào)F1株系07)、NNS-A 1(隴薯7號(hào)×MIN-021 F1株系A(chǔ)1)、NNS-A 6(隴薯7號(hào)×MIN-021 F1株系A(chǔ) 6)和NNS-A 10(隴薯7號(hào)×MIN-021 F1株系A(chǔ) 10)，原種由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯遺傳育種研究所保存、提供。各材料于2018年5月種植在呼和浩特市托克托縣馬鈴薯育種基地的網(wǎng)棚中，株距為25 cm，行距80 cm。土壤為沙壤土，肥力中等，生長(zhǎng)期間適時(shí)適量施肥灌水，以確保馬鈴薯生育對(duì)養(yǎng)分和水分的需求，并注意防除雜草和病蟲危害。

1.2 方 法

1.2.1DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

在馬鈴薯孕蕾期每種材料隨機(jī)取幼嫩的葉片用冰盒保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室，各稱取0.3 g放入研缽中，加適量液氮研磨成粉末，使用天根(北京)有限責(zé)任公司開發(fā)的植物基因組試劑盒提取其DNA。各取5μL的DNA溶液，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA的純度進(jìn)行檢測(cè)，將符合要求的DNA稀釋至50 ng·μL-1置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SRAP引物來源以及合成

本試驗(yàn)所用SRAP引物來源于Pezzotti[8]、Li[9]和Lin等[10]已開發(fā)報(bào)道的引物，正向引物、反向引物均為12個(gè)，自由組合共獲得144對(duì)SRAP引物，委托上海生工有限公司進(jìn)行合成。

1.2.3SRAP-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及程序

體系：反應(yīng)液總體積共20μL，含上下游引物各1.2μL、5 U·μL-1的Taq DNA聚合酶0.15μL、含Mg2+的10×PCR Buffer 2.75μL、2 mM的dNTPs 2.0μL、25 ng·μL-1的模板DNA 2.0μL、ddH2O 10.7μL。

程序：用Bio-Rad Mycycler Thermal Cycler儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94 ℃模板DNA預(yù)變性4 min；94 ℃下變性60 s，35 ℃下復(fù)性60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)5次；94 ℃下變性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35次；72 ℃下延伸10 min，于4 ℃終止反應(yīng)，取出置4 ℃冰箱低溫保存。

1.2.4變性及電泳檢測(cè)

在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性劑5μL，94 ℃下變性5 min，冷卻至4 ℃時(shí)點(diǎn)樣。PAGE凝膠濃度為6%，電泳恒定功率70 W，電泳約80 min。電泳后膠板置固定液15 min，取出膠板用蒸餾水漂洗2 min，放入銀染液中染色15 min，蒸餾水漂洗5 s后放入顯影液中10 min，將顯色后的膠板晾干掃描照相。

1.2.5SRAP多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)及聚類分析

利用0/1賦值法對(duì)SRAP擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，能清晰分辨的條帶標(biāo)記為“1”，沒有條帶的標(biāo)記為“0”，缺失記“-”，生成“0”、“1”的原始二元數(shù)據(jù)矩陣。多態(tài)性條帶位點(diǎn)百分率(%)=(多態(tài)性條帶數(shù)/擴(kuò)增條帶總數(shù))×100%，即P=(K/N)×100%[11]。

利用軟件Data Processing System V 8.01計(jì)算出各新品系間的遺傳距離，采用非加權(quán)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯新品系基因組DNA的質(zhì)量檢測(cè)

從圖1看出，10個(gè)馬鈴薯新品系DNA電泳條帶清晰、均勻且穩(wěn)定，沒有彌散和拖尾現(xiàn)象，表明所提取的DNA質(zhì)量可以滿足SRAP分子標(biāo)記試驗(yàn)的要求，可用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注：M.D 2000；1.NNCS-38；2.NNCS-46；3.NNCS-02；4.NNS-MB 9；5.NNS-B 12；6.NNS-WD 35；7.NNS-07；8.NNS-A 1；9.NNS-A 6；10.NNS-A 10。 圖1 10個(gè)馬鈴薯品系的基因組DNA質(zhì)量電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 馬鈴薯新品系SRAP適宜引物的篩選和多態(tài)性分析

用馬鈴薯新品系NNCS-38、NNS-07、NNS-WD 35和NNS-A 1這4個(gè)材料的DNA為模板進(jìn)行SRAP引物篩選，從144對(duì)引物中篩選出電泳條帶穩(wěn)定清晰、多態(tài)性豐富的SRAP引物10對(duì)(圖2、表1)。用這10對(duì)引物對(duì)10個(gè)馬鈴薯新品系基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的DNA片段范圍在300～1 000 bp之間，共產(chǎn)生208個(gè)位點(diǎn)條帶；其中多態(tài)性位點(diǎn)條帶165個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)條帶16.5個(gè)，多態(tài)性比率占79.33%，表明10個(gè)新品系間的遺傳差異較大。

表2 馬鈴薯品系間的SRAP遺傳距離矩陣

表1 SRAP適宜引物的堿基序列和多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果

引物上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')擴(kuò)增位點(diǎn)總數(shù)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)多態(tài)性位點(diǎn)百分率/%m1/e7TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTCAA161381.25m2/e6TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGCA342676.47m3/e1TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTAAT221881.82m3/e3TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGAC201680.00m5/e10TGAGTCCAAACCGGAAGGACTGCGTACGAATTCAG211676.19m9/e6TGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTGCA211780.95m9/e9TGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTCGA201575.00m12/k2TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTCGAG201785.00m14/be7TGAGTCCAAACCGGCTAGACTGCGTACGAATTCAA191578.95bm8/be10TGAGTCCAAACCGGACTGACTGCGTACGAATTCAT151280.00合計(jì)208165 79.33(均值)

注：1.NNCS-38；2.NNS-07；3.NNS-WD 35；4.NNS-A 1。圖2 馬鈴薯新品系部分SRAP適宜引物的篩選結(jié)果

另外，通過對(duì)10對(duì)適宜引物電泳結(jié)果的比對(duì)，選出1對(duì)能在DNA水平上清晰地區(qū)分出各新品系的SRAP引物m 3/e 1，經(jīng)PCR擴(kuò)增建立了10個(gè)馬鈴薯品系的SRAP指紋圖(圖3)，為新品種的登記和保護(hù)利用提供了分子依據(jù)。

2.3 馬鈴薯新品系的聚類分析

由表2可知，10個(gè)馬鈴薯新品系的遺傳距離(GD值)變幅在0.219 5～0.740 5之間，平均值為0.502 7。其中新品系NNS-A 1與NNS-A 10的GD值最大，為0.740 5；其次是NNS-A 1與NNS-A 6，GD值為0.708 1；GD值最小的是NNS-A 6與NNS-A 10，為0.219 5。

注：M.100 bp；1.NNCS-38；2.NNCS-46；3.NNCS-02；4.NNS-MB 9； 5.NNS-B 12；6.NNS-WD 35；7.NNS-07；8.NNS-A 1；9.NNS-A 6；10.NNS-A 10。圖3 用特異性引物m 3/e 1對(duì)10個(gè)馬鈴薯品系 基因組DNA擴(kuò)增的SRAP指紋圖

10個(gè)馬鈴薯材料聚類分析結(jié)果如圖4所示。以GD值0.50為基準(zhǔn)，可將10個(gè)馬鈴薯新品系分為4類：第一類為新品系NNCS-38、NNCS-46和NNS-07；第二類為新品系NNS-MB 9、NNS-WD 35、NNS-A 6和NNS-A 10；第三類為新品系NNS-B 12和NNS-A 1；新品系NNCS-02單獨(dú)為一類。該研究結(jié)果可為進(jìn)一步開展馬鈴薯改良雜交材料選擇和組配提供可靠依據(jù)。

注：1.NNCS-38；2.NNCS-46；3.NNCS-02；4.NNS-MB 9； 5.NNS-B 12；6.NNS-WD 35；7.NNS-07；8.NNS-A 1； 9.NNS-A 6；10.NNS-A 10。圖4 10個(gè)馬鈴薯品系的聚類結(jié)果

3 討 論

SRAP分子標(biāo)記技術(shù)因具有引物通用性廣、多態(tài)性豐富、成本低廉的特點(diǎn)[12]，已被應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建、QTL定位及品種鑒定等方面，如甜瓜[13]、國(guó)蘭[14]、冰草[15]、小麥[16]、藍(lán)莓[17]等。本試驗(yàn)用篩選出的10對(duì)SRAP適宜引物，對(duì)課題組選育出的10個(gè)馬鈴薯新品系基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及多態(tài)性分析顯示，各材料間的多態(tài)性比率較高(79.33%)，并用篩選出的1對(duì)特異性引物m 3/e 1，建立了能清晰地識(shí)別出各材料差異的SRAP指紋圖，這表明SRAP技術(shù)用于馬鈴薯新品系鑒定是可行的。

作物的聚類分析是將不同品種、品系材料按照親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近進(jìn)行分類的過程，在同一類別的品種或品系間有較高的遺傳相似性，而不同類別的品種或品系間遺傳差異性較大。為了拓寬遺傳背景，提高雜交后代性狀變異的幾率，通常在雜交親本選擇過程中需選擇親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的材料。聚類分析的結(jié)果可清晰、直觀的體現(xiàn)出各材料間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的程度，減少在親本選配時(shí)的盲目性，有效地縮短遺傳改良的進(jìn)程。本試驗(yàn)以遺傳距離(GD值)0.50為基準(zhǔn)時(shí)，將10個(gè)馬鈴薯新品系材料清晰地區(qū)分為4類，其中新品系NNS-MB 9、NNS-WD 35、NNS-A 6和NNS-10為一類，表明其親緣關(guān)系相對(duì)較近；但品系NNS-MB 9和NNS-WD 35為同一亞類，而品系NNS-A 6和NNS-10為另一相同亞類，這表明兩者間仍存在一定的遺傳差異。此外，在田間觀察到，品系NNS-MB 9和NNS-WD 35均為中早熟，品系NNS-A 6和NNS-10為中晚熟，二者在熟性上相差10 d以上，表明這種熟性上的差異與2個(gè)不同亞類的劃分具有一定的相關(guān)性，其原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

1) 試驗(yàn)篩選出10對(duì)適宜馬鈴薯新品系的SRAP引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到多態(tài)性位點(diǎn)條帶165個(gè)，多態(tài)性比率為79.33%，品系間的遺傳差異較大。

2) 用特異性引物m 3/e 1進(jìn)行擴(kuò)增和凝膠電泳建立了能明確識(shí)別10個(gè)馬鈴薯新品系的SRAP指紋圖譜，為下一步新品種登記及保護(hù)利用提供了分子依據(jù)。

3) 10個(gè)馬鈴薯新品系間的遺傳距離(GD值)范圍為0.219 5～0.740 5，平均值0.502 7。以GD值0.5為基準(zhǔn)，將10個(gè)馬鈴薯優(yōu)良新品系劃分成四類：新品系NNCS-38、NNCS-46和NNS-07為一類；新品系NNS-MB 9、NNS-WD 35、NNS-A 6和NNS-A 10為一類；新品系NNS-B 12和NNS-A 1為一類；新品系NNCS-02單獨(dú)為一類。這一研究結(jié)果可為進(jìn)一步進(jìn)行馬鈴薯改良雜交材料的組配利用提供依據(jù)。