史 偉， 韋獻雅， 付紹宏2， 陽 翠3， 陳志國

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院， 四川 成都 611130； 2.成都市農(nóng)林科學(xué)院， 四川 成都 611130； 3.四川省農(nóng)業(yè)科院經(jīng)濟作物育種栽培研究所， 成都 611130)

馬鈴薯是第四大糧食作物，在全球糧食安全中發(fā)揮著重要作用。然而，對于馬鈴薯的基因和基因組研究卻一直落后于大多數(shù)主要作物。

由致病卵菌引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯寄主(茄屬)晚期枯萎病的原因，嚴(yán)重導(dǎo)致世界范圍內(nèi)馬鈴薯損失[1]。盡管已有針對性的研究，然而對馬鈴薯晚疫病攻擊抗性和易感性的差別尚未完全了解。2011年出版的馬鈴薯基因組序列提供了新的數(shù)據(jù)，其對馬鈴薯遺傳學(xué)和育種研究有新的見解。另一方面，測序技術(shù)的進步使得從研究基因活動的時間和空間分布的大量的組織、時間和空間點中獲得完整轉(zhuǎn)錄物組(RNA-seq)的深度測序成為可能?；谶@些技術(shù)，人們對DNA測序的關(guān)注已經(jīng)開始從主要用于生產(chǎn)基因組序列的數(shù)據(jù)生成工具轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的功能基因組學(xué)工具上。在本研究中，使用對馬鈴薯晚疫病反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄序列，研究四倍體的馬鈴薯中調(diào)節(jié)基因?qū)ι锩{迫的響應(yīng)作用。最近，一組分子質(zhì)量從20到25 kDa不等且來自馬鈴薯塊莖的蛋白質(zhì)才被報道[2]。其中一些蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)是多種多樣的昆汀類蛋白酶抑制劑，這些抑制劑可能在馬鈴薯應(yīng)對昆蟲和植物病原體攻擊的自然防御機制中發(fā)揮重要作用。它們通常存在于儲存組織中，也可在樹葉中檢測到，以應(yīng)對多種食草性昆蟲和真菌病原體的攻擊。例如，在液泡中發(fā)現(xiàn)能調(diào)動種子萌發(fā)時胚乳貯藏蛋白質(zhì)的植物半胱氨酸蛋白酶。同樣，也能在某些物質(zhì)的胞外介質(zhì)中找到半胱氨酸蛋白酶，如木瓜和無花果[3]。作為殺蟲蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制劑的作用已被報道：奧雷扎·賽斯丁(riceCPI)Ⅰ和Ⅱ是不同品種的豆害蟲生長發(fā)育遲緩的原因[4]。然而，要直接獲得證明基因在決定特定性狀作用的證據(jù)，必須采用功能基因組學(xué)方法。一種是常用于植物基因功能快速分配的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)法[5]。在植物中，細(xì)胞質(zhì)RNA沉默可以通過農(nóng)桿菌滲入法進行有效誘導(dǎo)，T-DNA載體的瞬時表達的策略。瞬時表達的單個或雙鏈RNA組成的DNA編碼，通常是一個發(fā)夾(hp)RNA。因為它們提供了一種快速、通用和方便的方法，以實現(xiàn)在葉子的獨特和確定的區(qū)域達到高水平的基因表達，因此農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬態(tài)表達系統(tǒng)在誘導(dǎo)沉默過程中發(fā)揮了重要作用[6]。通過T-DNA編碼hpRNAs(雙鏈RNAs(dsRNAs)來源于反向重復(fù)的雜化)的瞬態(tài)表達的農(nóng)桿菌滲入法，能有效誘導(dǎo)瞬態(tài)細(xì)胞質(zhì)RNA沉默。與hpRNA轉(zhuǎn)基因的農(nóng)桿菌滲透實現(xiàn)瞬態(tài)RNAi誘導(dǎo)的沉默的方法，已經(jīng)在尼哥提亞物種、葡萄藤葉、草莓果實、石斛蘭的葉子中成功應(yīng)用[7-9]。利用RNAi結(jié)構(gòu)開發(fā)轉(zhuǎn)基因土豆線需要很長時間，因此這項技術(shù)只能用于靶向有限數(shù)量的馬鈴薯基因[10-12]。由于瞬態(tài)基因檢測技術(shù)能讓基因功能的快速分析具有額外的優(yōu)勢，且可替代穩(wěn)定轉(zhuǎn)換，同樣的細(xì)菌也可以被應(yīng)用到生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因線上。在本研究中，通過農(nóng)桿菌滲入法生產(chǎn)了針對PCPI的用于測試在馬鈴薯中獲得瞬態(tài)基因沉默可能性的dsRNA構(gòu)造，來確定候選基因在基因調(diào)控的馬鈴薯晚疫病抗性中的作用。

1 材料和方法

1.1 植物材料

所有的實驗都是在馬鈴薯中薯5號上進行。供試植物均在溫室中含泥炭苔蘚的罐子里栽培(溫度23±1 ℃，16 h光周期，濕度80%)。

1.2 轉(zhuǎn)錄組分析

為了在下一代測序(NGS)的時間內(nèi)生成抗性轉(zhuǎn)錄組概況，在溫室里，抗性品種中薯5號的3份復(fù)制品接種了疫病菌隔離種群。使用RNAzol，于不同時間點接種分離mRNA之后，與3個復(fù)制品的制備方法一樣，制備一個合并的樣本。使用NGS,5500 XL固體應(yīng)用生物系統(tǒng)對分離的mRNAs進行測序，序列讀取被組裝成片段，歸一化，分析折疊變化，根據(jù)CLC基因組學(xué)工作臺4.8(64位)軟件讀取每百萬個堿基的數(shù)字。根據(jù)與對照組比較的基因的表達水平，選擇部分表達水平上調(diào)的基因，使用BLASTn，與NCBI數(shù)據(jù)庫中馬鈴薯基因組序列排成一行。

1.3 總RNA提取、cDNA合成和克隆

在液氮中使冷凍葉片(100 mg)均質(zhì)化，利用核自旋RNAⅡ試劑盒提取總RNA。

用納米滴定法測定核酸的濃度和純度，通過在1%瓊脂糖凝膠的電泳實驗檢查完整性。根據(jù)制造商的指示，從純化的RNA方法合成了cDNA。該產(chǎn)品被用作基因克隆和表達分析的模板。使用聚合酶擴增672-bp對應(yīng)NM_001318627編碼序列(CDS)，設(shè)計一種克隆引物以擴增如下的CDS：PCPIF:5-TGATGAAGTCGATTAATATTTTGAG-3和PCPIR 5-GCTCC TAC GCC TT GATGAACACAGATG-3。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)熱4 min，94 ℃加熱30 s重復(fù)35次，57 ℃加熱30 s，72 ℃加熱40 s，72 ℃下延長7 min。用1.2%(w/v)瓊脂糖TAE凝膠的電泳法分析全部PCR產(chǎn)物。利用pGEM-T Easy載體系統(tǒng)(Promega，美國)，將這些PCR產(chǎn)物克隆到TA克隆載體中，然后測序。序列驗證了pGEM-T Easy的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化為DH5alpha大腸桿菌，對克隆的質(zhì)粒DNA測序驗證插入情況。序列證明PCR與S.tuberosum的PCPI相同。

1.4 構(gòu)造hpRNAi載體

PCPI(NM_001318627)基因的全長度cDNA克隆編碼用作RNA合成的模板。分析質(zhì)粒DNA，用于PCR反應(yīng)的模板。在本研究中，500個基點的片段被選擇為RNA沉默的靶點。從克隆的的DNA聚合酶鏈反應(yīng)擴增2個500個基點的DNA片段。

設(shè)計引物，獲得2個PCR產(chǎn)物(“正向”和“反向”片段)，隨后以相反方向克隆獲得發(fā)夾構(gòu)造。用于擴增感官片段的引物是PCPIXhoIF-5′-CGGCTCGAGATGAAGTCGATTAATATTTTG-3，PCPIKpn 1 R 5-AGCGGTACCTCATAATCTTGAAGATGTC-3，分別在它們的5端包含一個Xho1和一個KpnⅠ限制站點(在其中用下劃線標(biāo)注的序列)。用于擴增反義片段的引物為PCPIXba 1 F 5′-GCGTCTAGAATGAAGTCGATTAATATTGAG 3和PCPIClaR 5-ACGATCGATTCATAATCTTGAAGATGTC-3，在5端包括Xba 1和Cla 1位點(序列中用下劃線標(biāo)注)。用50μL總反應(yīng)容積進行DNA擴增。5μL cDNA與4μL的擴增混合物進行混合，擴增混合物包括每種dNTP 50 mM，每種引物120 nM，1 mM MgCl2，1 U Taq DNA聚合酶和10μL Taq緩沖液。PCR循環(huán)如下：在94 ℃時，20 s變性40次，52 ℃下退火30 s，72 ℃下退火45 s，72 ℃時延長退火時間到5 min。這些PCR產(chǎn)品被克隆到PCRTM2.1-TOPO?定向質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為全球前10主管E桿菌細(xì)胞(表達載體)。使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化DNA，隨后配入pKANNIBAL載體，根據(jù)花椰菜花葉病毒(CaMV)35 S啟動子和章魚合酶(OCS)終止劑轉(zhuǎn)錄控制的適當(dāng)方向的序列，然后將該結(jié)構(gòu)引進大腸桿菌DH 5 alfa。使用GenElute質(zhì)粒微型預(yù)置組件(Sigma)純化質(zhì)粒后，將足底表達的整個表達元素從限制性酶PstI和SacI中切除，并入pCAMBIA 1302載體。通過電穿孔進入ElectroMAXTM根癌土壤桿菌LBA 4404細(xì)胞(Invitrogen)，引入獲得的質(zhì)粒，用于馬鈴薯的葉子滲透。

1.5 馬鈴薯葉子的農(nóng)桿菌滲入

含有基因構(gòu)造的農(nóng)桿菌LBA 4404在50 mL的YM培養(yǎng)基上生長過夜，培養(yǎng)基含5μg·mL-1利福平和10μg·mL-1四環(huán)素，因為LBA 4404對利福平和四環(huán)素抗生素有耐藥性。這些細(xì)胞以4 400 r·min的離心率分離10 min，重新懸浮于50 mL MMA培養(yǎng)基(MS鹽，10 mM MES，pH=5.6，200μM丁香酮)。調(diào)整OD600為0.5～0.8用于瞬態(tài)表達研究，并在28 ℃中至少培養(yǎng)2 h。在溫室中種植cv(中薯5號)4～5周，然后使用。之后將細(xì)菌懸液存于注射器中并滲透到葉的背面。從植物基部，使農(nóng)桿菌屬培養(yǎng)滲透到第3葉柄的3片樹葉中。接種組植物，一種為PCIP構(gòu)造，另一種是野生型pCAMBIA 1302載體。浸潤3 d后，從每棵植物中收獲1片葉子，在紫外光下觀察，然后，通過拍照來檢測GFP表達。

注：基因沉默馬鈴薯葉片(a)的晚疫病癥狀與對照的葉片(b)感染。圖1 疫霉菌感染后7 d的葉片

1.6 分離葉片試驗

在添加2%蔗糖的黑麥瓊脂培養(yǎng)基中生長疫霉菌感染的avr 1、3、4、7、10、11分離株，時間為10～15 d，溫度為15 ℃，以便在培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)孢囊形成。為了從孢子囊釋放游動孢子，在培養(yǎng)皿中加入了冰冷的水，接著在4 ℃下培養(yǎng)3 h。游動孢子的濃度調(diào)整到5×104孢子·mL-1。從植物的上半部分切除在浸潤后生長并擴張的葉子，在有50μL的孢子囊懸浮液下端接種。在封閉的玻璃中，將接種的葉子用濕紙巾保存，在培養(yǎng)皿培養(yǎng)(15 ℃,16 h光周期)，并每天檢查有無損傷。使用數(shù)字卡尺(Helios DIGI-MET)，在接種后3～6 d測量病變直徑。

1.7 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)

在15 d的滲透時間內(nèi)，收集被浸潤植物的葉子。采集與接種同一階段的葉子，用于分析PCPI的轉(zhuǎn)錄水平。從葉子組織中提取總RNA。使用合成cDNA的方法生成cDNA，用于確定轉(zhuǎn)錄水平。遵循制造商的方法，基于SYBR綠色檢測系統(tǒng)，使用StepOne定量PCR系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng))，由兩步測量qRT-PCR技術(shù)確定內(nèi)源性mRNA水平。使用引物表達軟件(應(yīng)用生物系統(tǒng))，設(shè)計qRT-PCR引物。用以下引物擴增PCPI的轉(zhuǎn)錄：qF：5-ctctttggttgcctttgctc-3，qR(5-cgtttgggcatgtaaggttt-3)。PCR循環(huán)條件包括95 ℃下持續(xù)5 min的1個周期，95 ℃下持續(xù)20 s的45個周期，60°下持續(xù)40 s的45個周期。通過與馬鈴薯伸長因子1 α(EF1A)基因(AB 061263)比較，對相關(guān)的基因表達進行歸一化?；?AB 061263)在許多組織中都有表達，是馬鈴薯中一種有用的內(nèi)部實時PCR內(nèi)源線控制。使用形成的熔融曲線確定擴增反應(yīng)的特異性。對于每個樣本，反應(yīng)進行3次生物復(fù)制，每個實驗重復(fù)3種技術(shù)。采用DDCt方法確定與EF1A內(nèi)源性控制相關(guān)的目標(biāo)基因數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 PCPI基因的克隆和RNAi表達載體的構(gòu)建

在cDNA和基因組DNA(基因庫，NM_001318627)中均成功克隆了PCPI基因，并在相應(yīng)克隆體的測序分析中發(fā)現(xiàn)了672 bp羊痘瘡(ORF)的存在?；蚪M復(fù)制體中沒有內(nèi)含子，這是一種對抑制蛋白所熟悉的模式。在pKANNIBAL質(zhì)粒的35 S啟動子后，將500 bp的部分序列置于正義和反義取向，最后使用Sac1和Pst1限制克隆酶，在pCAMBIA 1302中克隆。該載體有第2個35 S啟動子，驅(qū)動GFP轉(zhuǎn)錄。農(nóng)桿菌滲入后的72 h，監(jiān)測GFP，確定在浸潤部位農(nóng)桿菌介導(dǎo)的質(zhì)粒的成功轉(zhuǎn)化。

2.2 分離葉片試驗

使用馬鈴薯晚疫病菌株接種的15 d舊沉默葉片，同時選擇cv葉子，中薯5號被用作抵抗性參照物，確定PCPI候選基因的沉默是否影響到晚疫病的易感性。接種的葉片進行了3～7 d后期接種(dpi)的視覺觀察，測量病變尺寸，繪制病變生長隨時間的關(guān)系曲線(圖1和圖2)。在7 d的實驗中，沒有觀察到野生型中薯5號的病變擴張和水浸潤，而廣泛的水浸潤性病變在沉默的植物中很明顯。感染后3 d，在野生型葉上出現(xiàn)過敏性反應(yīng)(HR)病變。在沉默的葉子中，3～7 dpi期間病變尺寸的發(fā)展呈穩(wěn)步增長趨勢(圖2)。在7 dpi時，沉默葉子上接種部分有明顯的芽孢。相比之下，在7個dpi時間內(nèi)，具有抗性的中薯5號參照植物的葉片上看不到病灶生長，沒有檢測到孢子。因此，PCPI基因的沉默導(dǎo)致了馬鈴薯晚疫病抗性的降低。

圖2 抗性控制cv(中薯5號)和沉默植物的 接種葉片的病灶大小發(fā)展

2.3 PCPI轉(zhuǎn)錄的表達分析

為了探討RNAi對靶基因豐度的影響，用RNAi和空構(gòu)法浸潤植物，從一組沉默的和參照的植物中提取出總RNA。結(jié)果表明，在沉默的植物中，該基因的轉(zhuǎn)錄豐度明顯減少，盡管顯示不同的降低范圍取決于所測試的植物(圖3)?？偟膩碚f，與非沉默的參照植物對比，在沉默的植物中，PCPI的轉(zhuǎn)錄水平降低了87.8%～93.94%(圖3)。在15 d的測試中，這些降低的水平仍然很低，表明持續(xù)的沉默和對馬鈴薯晚疫病的敏感性。

3 討 論

為了提供潛在抗性因子的基因特異性分析，采用基因沉默方法，測試一種特定基因產(chǎn)物參與限制病灶發(fā)展的過程。在本研究中，由于結(jié)構(gòu)產(chǎn)物簡單、公共供應(yīng)、均一的植物易感性、綠色熒光蛋白(GFP)的存在，因此選擇農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化與載體pKANNIBAL和pCAMBIA 1302聯(lián)合。此外，在2個載體中，Sac 1和Pst 1 sites的存在保證了克隆的成功。農(nóng)桿菌滲透測定法被成功應(yīng)用于篩選N.benthamiana、西紅柿、馬鈴薯、葡萄藤中激活R基因介導(dǎo)的抗病性所需的候選信令組件[13-15]。使用了類似的技術(shù)篩選了晚期抗病性所需的候選基因，如PCPI基因。在我們的方法中，通過農(nóng)桿菌浸潤沉默目標(biāo)基因，將RNAi結(jié)構(gòu)引入抗蟲病馬鈴薯植株中。未沉默抗性中薯5號植物的感染會導(dǎo)致出現(xiàn)超敏表型。如果該基因不參與抵抗，沉默候選基因不會影響超敏反應(yīng)(HR)表型。如果沉默候選基因(在這種情況下是PCPI)參與馬鈴薯晚疫病抗性，就會觀察到晚疫病的癥狀。在沉默植物樣本中，浸水病灶的分布超過75%被感染的葉面積，而在參照葉感染中沒有出現(xiàn)這種情況。由于一周時間沉默效果并不明顯，因此GFP表達是初始滲入成功的重要控制方式。

為了證實PCPI在馬鈴薯晚疫病抗性中的作用，使用包含自我補充的hpRNA構(gòu)造的內(nèi)部空間或內(nèi)含子，提高沉默效率。在本研究中，我們只使用了PCPI(500個基點)編碼序列的一部分。這將導(dǎo)致目標(biāo)基因和任何其他緊密相關(guān)的基因沉默。為了檢查對馬鈴薯半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因在轉(zhuǎn)錄水平時的抑制，我們進行了定量RT-PCR分析，在葉片浸潤后第15天，用pCAMBIA 1302攜帶的RNAi結(jié)構(gòu)，分析內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄水平。檢測到內(nèi)源性PCPI的表達水平顯著低于參照葉片。然而，從qRT-PCR基量化后觀察到的低水平可以得知，PCPI的沉默導(dǎo)致PCPI轉(zhuǎn)錄大幅減少，但不會完全消除PCPI轉(zhuǎn)錄。殘余轉(zhuǎn)錄水平是一個重要的因素，通過檢測殘余轉(zhuǎn)錄水平可以決定沉默是否是研究特定基因功能的合適方法。在具有調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)中，低水平的轉(zhuǎn)錄可以直接指導(dǎo)足夠的蛋白質(zhì)合成，使它難以準(zhǔn)確評估基因的功能。殘留的轉(zhuǎn)錄并非是種障礙，一般認(rèn)為，抑制劑蛋白質(zhì)和靶向蛋白之間的相互作用，能進入在正常的細(xì)胞條件下不會被釋放的一種結(jié)合狀態(tài)。

PCPI轉(zhuǎn)錄的減少，與在接種了馬鈴薯晚疫病孢子的沉默植物葉片上存在大量的水浸泡和更快的病灶擴張率有關(guān)。這意味著在疫病菌蛋白酶與抑制劑蛋白之間存在相互作用。關(guān)于半胱氨酸及其抑制劑介導(dǎo)的防御機制，植物半胱氨酸蛋白酶在程序性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的過敏性(HR)反應(yīng)及病原體攻擊調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在此病例中，半胱氨酸蛋白酶的沉默導(dǎo)致敏感性增強，而抑制劑沉默則會增強耐藥性。這個假設(shè)已經(jīng)得到驗證：半胱氨酸蛋白酶的異位表達抑制誘導(dǎo)的半胱氨酸蛋白酶活性，進而阻斷了程序性細(xì)胞死亡。另一方面，一些植物病原真菌可產(chǎn)生細(xì)胞外蛋白酶，其在參與疾病的發(fā)展中起到積極作用。植物蛋白酶抑制劑對植物防御機制的貢獻依賴于由微生物產(chǎn)生的蛋白酶的抑制作用。蛋白酶抑制劑的活性是因其具備與目標(biāo)蛋白酶形成穩(wěn)定復(fù)合物的能力，阻斷、改變或阻止進入到酶活性位點。本研究表明，PCPI在抑制由馬鈴薯晚疫病生產(chǎn)的細(xì)胞外半胱氨酸蛋白酶具有重要作用，在抗性品種中薯5號中具有抵抗能力。因此，抑制PCPI基因的結(jié)果能增強抗性品種的敏感性，暗示這些抑制劑是馬鈴薯防御機制應(yīng)對病原體的一部分。筆者的結(jié)果也與幾項以前的發(fā)現(xiàn)一致，指出植物合成抑制多肽可以抑制酶活性，應(yīng)對由植物病原微生物產(chǎn)生的蛋白酶的攻擊。這一現(xiàn)象首次在感染致病疫霉的番茄中記錄，其中增加的胰蛋白酶和糜蛋白酶抑制劑水平與植物抵抗病原體有關(guān)。研究顯示，馬鈴薯塊莖積累了絲氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì)抑制劑，應(yīng)對馬鈴薯晚疫病的感染。此外，蕎麥種子的胰蛋白酶抑制劑抑制了植物性真菌中交鏈孢屬替代物和鐮刀菌屬的孢子萌發(fā)和菌絲生長。馬鈴薯塊莖中的胰凝乳蛋白酶抑制劑抑制了晚疫病的生長發(fā)育。此外，番茄中半胱氨酸蛋白酶C 14的沉默導(dǎo)致卵菌晚疫病易感性的增加。值得注意的是，盡管真菌疾病作為主要的生物脅迫因子對作物產(chǎn)量有顯著影響，但是在植物蛋白酶抑制劑對病原微生物的直接作用的理解程度要比它們對昆蟲的影響理解程度小得多。