胡江濤 李永麗

摘要 [目的]建立豆瓣醬中特丁基對苯二酚（TBHQ）檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。[方法]樣品中的TBHQ用甲醇提取，以C18作為分離柱，以電噴霧離子源在負(fù)離子檢測模式下多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）分析。[結(jié)果]方法的線性范圍為0.05～100.00 mg/L（r=0.999 1），方法的檢出限達(dá)0.25 mg/kg;回收率為80.9%～104.6%，RSD（n=5）≤8.3%。[結(jié)論]該方法能快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地檢測豆瓣醬中的TBHQ。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用;檢測;TBHQ;豆瓣醬

中圖分類號 TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0212-04

Abstract [Objective] The research aimed to establish a liquid chromatographytandem mass spectrometry（LCMS/MS） method for the determination of tertbutyl hydroquinone（TBHQ） in thick broadbean sauce.[Method] The TBHQ in the sample was extracted with methanol，and C18 was used as a separation column to analyze the multiple reaction monitoring（MRM） in the negative ion detection mode with an electrospray ion source.[Result]The linear range of the method was 0.05-100.00 mg/L（r=0.999 1），the detection limit was 0.25 mg/kg，and the recovery rates of TBHQ were 80.9%-104.6%，RSD was less than 8.3%.[Conclusion]The method can determine TBHQ in thick broadbean sauce quickly，conveniently，sensitively and accurately.

Key words LCMS/MS;Determination;Tertbutyl hydroquinone（TBHQ）;Thick broadbean sauce

特丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）是食品工業(yè)中廣泛使用的一種抗氧化劑，它可以提高食品的穩(wěn)定性，特別適用于動(dòng)植物脂肪以及富脂食品，但由于其具有潛在的毒性和致癌作用，為保護(hù)人體健康，我國明確規(guī)定了其在食品中的最大使用限量[1]。一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)出于維護(hù)本國經(jīng)濟(jì)利益和保護(hù)人們健康的需要，對進(jìn)口食品中TBHQ的殘留量等衛(wèi)生指標(biāo)提出了愈來愈嚴(yán)格的限量要求。尤其是日本尚未批準(zhǔn)TBHQ作為抗氧化劑在食品中使用，要求輸日食品中不得含有TBHQ。

目前測定TBHQ的方法較多，主要有高效液相色譜法[2-6]、氣相色譜法[7]和氣相色譜-質(zhì)譜法[8]等。其中高效液相色譜法是目前應(yīng)用最多的一種檢測方法。這些方法主要針對油脂樣品中TBHQ的檢測，存在著樣品前處理過程復(fù)雜、耗時(shí)長、選擇性不好、靈敏度不高和檢出限偏高的問題，不能滿足準(zhǔn)確、快速、簡便的檢測要求。

豆瓣醬是四川地區(qū)的特色產(chǎn)品之一，深受世界各地人們的喜歡，產(chǎn)品無論在國內(nèi)還是國外均有較大的消費(fèi)量。TBHQ是豆瓣醬質(zhì)量監(jiān)測的常檢項(xiàng)目之一。在實(shí)際檢測工作中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法不太適用于該類產(chǎn)品中TBHQ殘留量的檢測[9]。由于豆瓣醬基質(zhì)較為復(fù)雜，檢測時(shí)會(huì)出現(xiàn)較大的干擾，影響定性判斷，極易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。同時(shí)由于干擾較大，影響定量的準(zhǔn)確性。該研究建立了快速、準(zhǔn)確、簡便地檢測豆瓣醬中TBHQ的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法，并在實(shí)際工作中得到較好的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀配ESI源（液相色譜，LC-30A，日本島津;串聯(lián)質(zhì)譜儀，API4000，美國AB公司）;電子分析天平（XS205，梅特勒托利多儀器有限公司）;微型旋渦混合器（WH-3型，上海滬西分析儀器廠有限公司）;冷凍高速離心機(jī)（3-30K，Sigma，德國）;尼龍針式過濾頭（0.45 μm，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈（ HPLC 級，F(xiàn)isher Scientific，美國）;無水乙醇（分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）;氨水（分析純，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）;冰乙酸（分析純，天津市化學(xué)試劑六廠）;超純水（Milli-Q integral 3，MILLIPORE公司，美國）;TBHQ標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度980%，Dr.Ehrenstorfer公司，德國）。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件。色譜柱（SB-C18，150 mm×2.1 mm×3.5 μm，Agilent公司）;柱溫35 ℃;流速 0.3? mL/min;流動(dòng)相為甲醇-水梯度洗脫（0～5 min，甲醇從10%升至90%;5～8 min，甲醇90%;8.0～8.5 min，甲醇從90%降為10%;8.5～12.0 min，甲醇10%）;進(jìn)樣體積5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件。電噴霧（ ESI）負(fù)離子模式;選擇反應(yīng)檢測（MRM）;母離子m/z 165，子離子m/z 149（碰撞能量CE，35 eV）和m/z 108（碰撞能量CE，30 eV）;霧化氣（氮?dú)猓?48.16 kPa;干燥氣（氮?dú)猓?48.16 kPa;氣簾氣103.42 kPa;溫度400 ℃。

1.4 樣品測定

取有代表性試樣（2.00±0.10） g，至50 mL離心管中，加入5? mL甲醇，旋緊蓋子，置于渦旋混勻器上混勻，5 000 r/min離心10 min。殘?jiān)?? mL甲醇重復(fù)提取一次，合并提取液。取上清液1.0 mL，0.45 μm過濾膜過濾，收集清液于進(jìn)樣瓶中，用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)聯(lián)用儀測定，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

TBHQ的質(zhì)譜條件是通過針泵把濃度為1 mg/mL的TBHQ標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀優(yōu)化得到的。設(shè)置Q1為全掃描模式，掃描范圍m/z 100～200，在正離子模式下沒有觀察到豐度較強(qiáng)的質(zhì)譜信號;負(fù)離子模式下可以觀察到較強(qiáng)的基峰m/z 165的質(zhì)譜圖（圖1）。此基峰應(yīng)為分子中失去H形成的[M-1]-型分子離子峰。TBHQ分子量為166，分子結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)羥基（-OH），具有弱酸性，易去質(zhì)子化形成負(fù)離子，與質(zhì)譜數(shù)據(jù)相吻合。Q1選擇m/z 165為母離子，Q3選擇全掃描模式掃描范圍m/z 30～170，施加一定的碰撞能量，可以得到二級質(zhì)譜圖（圖2）。從圖2可以看出，母離子m/z 165 的二級質(zhì)譜中除了母離子之外，主要的碎片離子為m/z 149，來自于叔丁基上甲基的斷裂丟失;另有主要的碎片離子為m/z 108，主要由于苯環(huán)上叔丁基的斷裂丟失而生成。

目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測TBHQ的報(bào)道較少[10]，但使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測時(shí)靈敏度較差。該研究中發(fā)現(xiàn)TBHQ對離子源的條件較為敏感，氣流、溫度、去簇電壓等參數(shù)需要仔細(xì)優(yōu)化才能得到較好的靈敏度。一般情況下，離子源的溫度較高、氣流較大時(shí)，可以更好地去溶劑化，促進(jìn)目標(biāo)物的電離效率，從而提高靈敏度。TBHQ檢測時(shí)，離子源溫度對靈敏度影響最為關(guān)鍵，較低的溫度靈敏度最好。個(gè)人推測雖然電噴霧是一種軟電離方式不會(huì)直接破壞化合物結(jié)構(gòu)，但TBHQ作為一種抗氧化劑，其自身穩(wěn)定性較差，在高溫時(shí)發(fā)生降解從而影響檢測靈敏度。

2.2 色譜條件的選擇

液相色譜的條件一般分等度和梯度洗脫模式，只分析一種化合物時(shí)一般選擇等度分離模式?？紤]到該方法中要檢測的豆瓣醬基質(zhì)較為復(fù)雜，為避免干擾物在色譜柱上富集對分析產(chǎn)生干擾，該試驗(yàn)中選擇了梯度洗脫模式，在方法中TBHQ的保留時(shí)間在5.3 min左右。

反相液相色譜流動(dòng)相常用的有機(jī)相是甲醇和乙腈。在試驗(yàn)中比較了甲醇和乙腈分別作為流動(dòng)相，二者對試驗(yàn)結(jié)果未產(chǎn)生明顯差異。綜合考慮（成本、毒性等），該研究選擇了甲醇作為流動(dòng)相。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

以水為稀釋溶劑，配制TBHQ的質(zhì)量濃度為0.05、0.50、1.00、20.00和100.00 mg/L的溶液，液相色譜-質(zhì)譜重復(fù)測定3次，以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、待測物的峰面積為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.893x（r=0.999 1）。

目前常用的高效液相色譜法、氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法的檢出限在0.5 mg/kg以上，該方法中檢出限可以達(dá)到0.25 mg/kg，優(yōu)于上述方法的檢出限。高效液相色譜法、氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法采用梯度洗脫或程序升溫模式將TBHQ 峰與雜質(zhì)峰分開，通常需要15 min 以上，且雜質(zhì)的存在往往會(huì)干擾定性定量分析的準(zhǔn)確性。該研究只需12 min即可完成分析，采用TBHQ的子離子m/z 149作為定量離子分析，子離子m/z 108為定性離子，以二者的豐度比值作為定性確證依據(jù)，符合法規(guī)要求。即使有雜質(zhì)的情況下，也能準(zhǔn)確地對目標(biāo)物進(jìn)行檢測。

2.4 方法的準(zhǔn)確性和特異性

通過樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后分析的方式考察方法的準(zhǔn)確性。稱取15份豆瓣醬樣品，每份2 g，等分為3組。每組添加濃度分別為0.25、1.00和2.00 mg/kg，按照方法制樣和分析測定，計(jì)算回收率和變異系數(shù)，所得的數(shù)據(jù)見表1。

2.5 色譜柱及樣品提取條件的選擇

在液相色譜分離角度考慮，TBHQ對色譜柱的選擇不高，普通C18均可得到較好的峰形。但在實(shí)際檢測使用高效液相色譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同類型的色譜柱帶來對目標(biāo)物和干擾物不同的選擇性，同一個(gè)樣品在不同色譜柱下呈現(xiàn)出不同的干擾。因此檢測人員實(shí)際檢測時(shí)可以通過更換不同的色譜柱對疑似樣品復(fù)檢確認(rèn)，以得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。

該研究中采用串聯(lián)質(zhì)譜作為液相色譜的檢測器，由于質(zhì)譜高度的選擇性，不需要考慮干擾物對目標(biāo)物的影響。但不同色譜帶來的不同共洗脫物是否造成基質(zhì)效應(yīng)，需要在以后的工作中做進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)中選用普通的窄徑色譜柱，其最佳流速同離子源接口更匹配，可以得到最佳的靈敏度。

油脂中TBHQ檢測常用提取溶劑有甲醇、乙腈、正己烷、環(huán)己烷等，凈化手段通常采用凝膠色譜（GPC）。該研究的目的就是建立簡便快速的檢測方法，以適應(yīng)滿足實(shí)際樣品檢測尤其是高通量檢測的需要，因此采用了甲醇提取后直接進(jìn)樣分析的方式。

2.6 實(shí)際樣品檢測

近兩年來，成都海關(guān)技術(shù)中心和食品安全檢測四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室一直把該研究中的方法作為TBHQ檢測的重要的輔助技術(shù)手段使用。該法不但適用于豆瓣醬的檢測，且在香辣醬、火鍋底料等也有較好的效果。檢測多批次樣品，均取得了滿意的效果。圖5是工作中使用液相色譜檢測時(shí)的疑似陽性樣品，通過LC-MS/MS確證為陰性。圖6是其樣品的標(biāo)準(zhǔn)添加色譜圖，進(jìn)一步確證了LC-MS/MS檢測的準(zhǔn)確性。圖7是實(shí)際檢測時(shí)遇到的陽性樣品，經(jīng)LC-MS/MS定量確證。

3 結(jié)論

建立的豆瓣醬中TBHQ的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，處理簡單快捷，靈敏度高，適合大批樣品的高通量檢測。該方法定量的同時(shí)可以確證，極大降低了假陽性概率的發(fā)生，并在實(shí)際工作中取得了較為滿意的效果。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)：GB 2760—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[2] PINHO O，F(xiàn)ERREIRA I M P L V O，OLIVEIRA M B P P，et al.Quantification of synthetic phenolic antioxidants in liver ptés[J].Food Chem，2000，68（3）：353-357.

[3] PERRIN C，MEYER L.Quantification of synthetic phenolic antioxidants in dry foods by reversed-phase HPLC with photodiode array detection [J].Food Chem，2002，77（1）：93-100.

[4] KAROVICˇOV J，SˇIMKO P.Determination of synthetic phenolic antioxidants in food by highperformance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2000，882（1/2）：271-281.

[5] 李桂鳳，郝征紅，董淑敏.高效液相色譜法測定食品中抗氧化劑 BHA，BHT，PG[J].色譜，1998，16（3）：276-277.

[6] 胡小鐘，余建新，錢浩明，等.油脂中九種抗氧化劑的反相高效液相色譜法分離和測定[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，16（1）：23-26.

[7] YANG M H，LIN H J，CHOONG Y M.A rapid gas chromatographic method for direct determination of BHA，BHT and TBHQ in edible oils and fats[J].Food Res Int，2002，35（7）：627-633.

[8] 岳振峰，藍(lán)芳，謝麗琪.氣相色譜-質(zhì)譜法測定XO醬中BHA、BHT和TBHQ[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2004，19（5）：83-85.

[9] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品中9種抗氧化劑的測定：GB 5009.32—2016[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[10] 郝鵬鵬，倪晉仁，孫衛(wèi)玲，等.液相色譜/離子阱質(zhì)譜法檢測不同食用植物油中的叔丁基對苯二酚（TBHQ）[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2005，26（4）：222-227.