劉鑫陽(yáng) 田瑞華

摘要 [目的]研究黃貯對(duì)玉米秸稈的品質(zhì)及微生物多樣性的影響。[方法]采用現(xiàn)行有效的測(cè)定方法及高通量測(cè)序，對(duì)黃貯玉米秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及微生物進(jìn)行了研究。[結(jié)果]經(jīng)過(guò)98 d的黃貯，玉米秸稈的總酸含量提高了31.62%，粗纖維含量降低了39.92%，粗蛋白含量提高了8.53%，細(xì)菌群落豐富度和多樣性明顯降低，細(xì)菌群落組成由初始的藍(lán)藻科某些屬為主導(dǎo)變?yōu)橐匀樗峋鸀橹鲗?dǎo)。[結(jié)論]黃貯有效改善了秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及微生物群落組成。

關(guān)鍵詞 黃貯;高通量測(cè)序;微生物多樣性;營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

中圖分類號(hào) S816.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）19-0197-04

Abstract [Objective] To study the effects of yellowstorage on the quality and microbial diversity of corn straw. [Method] The nutritional quality and microbial diversity of yellowstorage corn straw feed were analyzed by using current effective methods and high throughput sequencing.[Result] The results showed that the total acid content of maize straw increased by 31.62%， cellulose content decreased by 39.92%， crude protein content increased by 8.53% after 98 days of yellowstorage. The richness and diversity of bacterial community decreased obviously， and the composition of bacterial community changed from initial miscellaneous bacteria to lactobacillusdominated structure distribution. [Conclusion] The nutritional quality and microbial community composition of straw feed were effectively improved by yellowstorage.

Key words Yellowstorage;High throughput sequencing;Microbial diversity;Nutritional quality

隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)肉制品的需求也不斷增加，使得畜牧業(yè)的發(fā)展越來(lái)越快，但同樣也面臨著自然環(huán)境變化、天然草場(chǎng)產(chǎn)量下降等問(wèn)題，開發(fā)新的能源已成為學(xué)者們熱切關(guān)注的問(wèn)題。我國(guó)秸稈資源非常豐富，年產(chǎn)量高達(dá)7億多t[1]，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的20%～30%，但用于制作飼料的量不到20%。若將這么多的秸稈焚燒會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，堆積會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，秸稈還田也會(huì)增加農(nóng)作物的倒伏以及病蟲害的危害。這些秸稈如果能被合理利用，制成飼料，不僅解決了資源浪費(fèi)和秸稈焚燒帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，而且解決了畜牧發(fā)展中存在的一些問(wèn)題。玉米秸稈主要是由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成，其質(zhì)地粗硬，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低，影響家畜的消化率和采食量。微生物發(fā)酵可以顯著降低玉米秸稈中半纖維素和纖維素的含量[2]，提高飼料作物的消化率[3]。通過(guò)微生物發(fā)酵既改善了玉米秸稈的適口性，也提高了玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

高通量測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)新興發(fā)展起來(lái)的免培養(yǎng)分子生物學(xué)技術(shù)，又稱新一代測(cè)序技術(shù)[4]。因?yàn)楦咄繙y(cè)序具有讀數(shù)長(zhǎng)、效率高、靈敏度高等特點(diǎn)，可最大限度地保留菌群原有的群落組成和分布特征，是一個(gè)研究微生物多樣性的重要手段[5-7]。目前，高通量測(cè)序技術(shù)在人類基因組、青貯微生物、腸道微生物、土壤微生物、植物根根際及內(nèi)生菌等多種環(huán)境微生物生態(tài)的研究中都有應(yīng)用[8-13]。高通量測(cè)序技術(shù)雖然已被廣泛應(yīng)用，但該技術(shù)在黃貯中應(yīng)用得較少，且目前對(duì)黃貯飼料中菌群結(jié)構(gòu)的研究基本處于空白。筆者利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了黃貯對(duì)玉米秸稈中微生物多樣性的影響，結(jié)合現(xiàn)行有效的方法分析了黃貯對(duì)玉米秸稈中總酸含量、粗纖維含量及粗蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

超低溫冰箱 DW-86L388A（青島海爾特種電器有限公司）、移液器 Eppendorf N13462C（Eppendorf）、小型離心機(jī) Eppendorf 5430 R（Eppendorf）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) Eppendorf 5424R（Eppendorf）、超微量分光光度計(jì) NanoDrop2000（Thermo FisherScientific）、電泳儀 DYY-6C（北京市六一儀器廠）、MISEQ 測(cè)序儀 Illumina Miseq（Illumina）、酶標(biāo)儀 BioTek ELx800（Biotek）。

1.2 主要試劑

DNA 抽提試劑盒、2% agarose gels、FastPfu Polymerase、AxyPrep DNA GelExtraction Kit、MiSeqplatform、FastDNASPINKitforSoil、酚酞、氫氧化鈉、纖維濾袋、濃硫酸、無(wú)水葡萄糖、纖維濾袋、混合催化劑、混合指示劑、硼酸、鹽酸、DNS試劑。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 采樣方法。

玉米秸稈黃貯池共3個(gè)，均為長(zhǎng)、寬、高各2 m的池子，玉米秸稈黃貯時(shí)間為98 d，分別在玉米秸稈黃貯封窖前及98 d黃貯結(jié)束過(guò)后進(jìn)行取樣。在黃貯池的1 m深處分別取5個(gè)樣，將取出的玉米秸稈樣品進(jìn)行充分混合，然后平均分成3份放入自封袋中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 黃貯秸稈樣品的品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定。

玉米秸稈黃貯過(guò)程中品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定參照現(xiàn)行有效的分析方法[14-16]。

1.3.3 Illumina Miseq 高通量測(cè)序。

1.3.3.1 DNA抽提與PCR擴(kuò)增。

參照FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒說(shuō)明書對(duì)玉米秸稈樣品進(jìn)行總DNA提取，并利用NanoDrop2000對(duì)DNA的純度和濃度進(jìn)行檢測(cè)，利用806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）和338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.3.2 Illumina Miseq測(cè)序。

利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司），將原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)。

1.3.3.3 數(shù)據(jù)處理。

原始測(cè)序的序列使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行質(zhì)控，并使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃貯玉米秸稈的品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

為了解黃貯玉米秸稈的表型特征，對(duì)黃貯玉米秸稈的總酸含量、粗纖維含量、粗蛋白含量這3個(gè)重要品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可以看出，通過(guò)黃貯發(fā)酵的玉米秸稈總酸含量由初始的8.57 g/kg升高到11.28 g/kg。與未進(jìn)行黃貯發(fā)酵的玉米秸稈相比，經(jīng)過(guò)黃貯發(fā)酵的玉米秸稈總酸含量提高了31.62%，這說(shuō)明黃貯顯著提高了秸稈中的總酸含量;粗纖維含量由初始的34.47%降低到20.71%，與未進(jìn)行黃貯發(fā)酵的玉米秸稈相比，經(jīng)過(guò)黃貯發(fā)酵后的玉米秸稈粗纖維含量降低了39.92%，說(shuō)明黃貯顯著降低了玉米秸稈中粗纖維的含量;粗蛋白含量由初始的3.87%提高到4.20%，與未進(jìn)行黃貯發(fā)酵的玉米秸稈相比，經(jīng)過(guò)黃貯發(fā)酵的玉米秸稈粗蛋白含量提高了8.53%，說(shuō)明黃貯有效提高了玉米秸稈中粗纖維的含量。

2.2 玉米秸稈黃貯的 Illumina Miseq 高通量測(cè)序

2.2.1 黃貯玉米秸稈樣品中細(xì)菌16S rRNA的Illumina測(cè)序的稀釋曲線。

稀釋曲線（rarefaction curve）主要利用各樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物α多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)據(jù)量時(shí)的微生物多樣性，也可以用來(lái)說(shuō)明樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。稀釋曲線采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們對(duì)應(yīng)的物種（OTU）數(shù)目或多樣性指數(shù)，構(gòu)建稀釋曲線。該研究采用Shannon-Wiener指數(shù)，選擇97%相似度的OTU水平，利用mothur計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)，利用R語(yǔ)言工具繪制稀釋曲線。當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多的新物種。

圖1為黃貯玉米秸稈樣品的細(xì)菌稀釋曲線，隨著樣本序列數(shù)的增加，檢測(cè)到OTU數(shù)量的增加量逐漸減小，曲線趨于平坦，這說(shuō)明該試驗(yàn)測(cè)序的數(shù)據(jù)量比較合理，通過(guò)檢測(cè)獲得了樣品細(xì)菌群落中絕大多數(shù)OTU水平上的物種。

2.2.2 黃貯玉米秸稈樣品中細(xì)菌的α-多樣性。

通過(guò)chao指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、物種覆蓋度指數(shù)對(duì)黃貯玉米秸稈樣品中細(xì)菌的α多樣性進(jìn)行分析。chao指數(shù)是描述物種豐富度chao1指數(shù)，是用chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，用來(lái)估計(jì)物種總數(shù);Shannon-Wiener指數(shù)是反映多樣性的指數(shù)，其值越高說(shuō)明群落多樣性越高;物種覆蓋度指數(shù)（coverage）是反映群落覆蓋度的指數(shù)，其數(shù)值越高則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒(méi)有被測(cè)出的概率越低，該指數(shù)反映此次測(cè)序結(jié)果是否代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

從表2可以看出，黃貯玉米秸稈樣品中細(xì)菌的物種覆蓋度均在0.99以上，說(shuō)明樣本中序列被測(cè)出的概率很高，且此次試驗(yàn)數(shù)據(jù)代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。經(jīng)過(guò)98 d黃貯后，3個(gè)黃貯池中玉米秸稈細(xì)菌的Shannon-Wiener指數(shù)和chao指數(shù)均顯著降低，說(shuō)明黃貯降低了玉米秸稈中細(xì)菌的豐富度和多樣性。

2.2.3 黃貯玉米秸稈樣品中細(xì)菌群落分類學(xué)分析。

2.2.3.1 黃貯玉米秸稈中細(xì)菌群落在門水平上的結(jié)構(gòu)分布。

通過(guò)與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈初始的細(xì)菌群落由19個(gè)門組成，經(jīng)過(guò)98 d黃貯后玉米秸稈中細(xì)菌群落變?yōu)?8個(gè)門。

從圖2可以看出，玉米秸稈初始的細(xì)菌群落中藍(lán)藻門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）占據(jù)明顯的優(yōu)勢(shì)地位，此外還有擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）等一些相對(duì)豐度較低的細(xì)菌門類。黃貯98 d后的細(xì)菌群落中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門占據(jù)明顯的優(yōu)勢(shì)地位，此外還有擬桿菌門和放線菌門等相對(duì)豐度較低的門類。這說(shuō)明黃貯明顯改變了細(xì)菌在門水平上的結(jié)構(gòu)分布。

2.2.3.2 黃貯玉米秸稈中細(xì)菌群落在屬水平上的結(jié)構(gòu)分布。

通過(guò)與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈初始的細(xì)菌群落由349個(gè)屬組成，經(jīng)過(guò)98 d黃貯后玉米秸稈中細(xì)菌群落變?yōu)?23個(gè)屬。

從圖3可以看出，玉米秸稈初始的細(xì)菌群落中藍(lán)藻科的某些屬占據(jù)明顯的優(yōu)勢(shì)地位，此外還有泛菌屬、鞘脂單胞菌屬、根瘤菌屬等一些相對(duì)豐度較低的屬。黃貯98 d后的細(xì)菌群落中，乳桿菌屬代替了藍(lán)藻科某些屬的優(yōu)勢(shì)地位，成為優(yōu)勢(shì)菌屬，此外還有片球菌、乳球菌等一些相對(duì)豐度較低的菌屬。由黃貯玉米秸稈中細(xì)菌群落在屬水平上的結(jié)構(gòu)分布可以看出，經(jīng)過(guò)98 d的黃貯，秸稈飼料中細(xì)菌群落的組成由一些雜菌變?yōu)槿樗峋鲗?dǎo)。乳酸菌分為同型發(fā)酵乳酸菌、異型發(fā)酵乳酸菌和兼性異型發(fā)酵乳酸菌。其中，同型發(fā)酵乳酸菌可以快速降低pH、增加乳酸菌數(shù)量和乳酸含量;專性異型發(fā)酵乳酸菌具有增加有氧穩(wěn)定性的作用;兼性異型發(fā)酵乳酸菌具有二者聯(lián)合的作用[17]。

3 結(jié)論

總酸含量是衡量玉米秸稈黃貯發(fā)酵秸稈品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，相對(duì)較高的總酸含量不僅可以抑制黃貯發(fā)酵秸稈中雜菌的生長(zhǎng)，而且可以增加黃貯發(fā)酵秸稈的有氧穩(wěn)定性。玉米秸稈飼料中纖維素的存在會(huì)影響飼料的適口性，含有很多不能被動(dòng)物消化和利用的物質(zhì)，因此降低玉米秸稈中的纖維含量是必要的;黃貯飼料中蛋白的存在可以有效改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，從而提高飼料的飼用價(jià)值，因此飼料中蛋白含量是衡量黃貯飼料品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)秸稈經(jīng)青貯后總酸的含量顯著提高，有效抑制了秸稈中有害菌的生長(zhǎng)，提高飼料的品質(zhì)。Hu等[19]、Nsereko等[20]、Zayed等[21]研究發(fā)現(xiàn)青貯可以顯著提高秸稈飼料的干物質(zhì)、粗蛋白等含量以及纖維素的降解率。該研究發(fā)現(xiàn)玉米秸稈經(jīng)黃貯后有效提高了玉米秸稈的總酸及粗蛋白的含量，顯著降低了秸稈的粗纖維含量，提高了玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，這與上述研究結(jié)果相似。

經(jīng)過(guò)黃貯發(fā)酵，玉米秸稈中的細(xì)菌豐富度和多樣性都有所降低。Li等[22]對(duì)丁香和黑麥草進(jìn)行青貯，結(jié)果表明青貯降低了丁香和黑麥草飼料的細(xì)菌豐富度，與該研究結(jié)果相似。Ogunade等[9]研究發(fā)現(xiàn)苜蓿青貯飼料細(xì)菌群落中74.1%和20.4%的細(xì)菌分別屬于厚壁菌門和變形菌門。Ogunade等[23]對(duì)玉米秸稈進(jìn)行青貯，通過(guò)對(duì)青貯飼料的細(xì)菌多樣性分析表明青貯可以改變飼料中的細(xì)菌群落組成。結(jié)果表明，玉米青貯飼料中涉及乳酸發(fā)酵的細(xì)菌群落中，98.3%屬于厚壁菌門，96.5%屬于乳酸桿菌屬，與該研究結(jié)果相似。

通過(guò)對(duì)黃貯玉米秸稈飼料的品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃貯有效改善了秸稈飼料中總酸、粗纖維和粗蛋白的含量。通過(guò)對(duì)黃貯玉米秸稈飼料的微生物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃貯顯著降低了秸稈飼料中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，并明顯改變了玉米秸稈飼料中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成。

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