崔家榮 段開紅

摘要 [目的]將檸條轉(zhuǎn)化為可被牲畜高效利用的優(yōu)良飼料。[方法]采用檸條作為單一碳源的篩選培養(yǎng)基、苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基從牲畜糞便以及檸條腐質(zhì)中分離篩選出對(duì)檸條木質(zhì)素具有降解作用的菌株D-11。[結(jié)果]經(jīng)微生物形態(tài)學(xué)和16S rDNA鑒定，D-11為地衣芽孢桿菌，同時(shí)對(duì)D-11降解條件進(jìn)行優(yōu)化。菌株D-11的最佳降解條件如下：最佳氮源為蛋白胨;溫度為28～32 ℃;pH為7;添加誘導(dǎo)劑Mn2+的濃度為0.6 mmol/L。在最優(yōu)條件下，菌株D-11對(duì)檸條木質(zhì)素降解率為18.21%，半纖維素的降解率為16.11%，纖維素的降解率為13.19%。[結(jié)論]采用菌株D-11對(duì)檸條進(jìn)行發(fā)酵降解，使其轉(zhuǎn)化為可被牲畜利用的優(yōu)良飼料。

關(guān)鍵詞 檸條;木質(zhì)素;木質(zhì)素降解菌;篩選;發(fā)酵降解;降解條件優(yōu)化

中圖分類號(hào) S816.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）19-0107-03doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.031

Abstract [Objective] To convert Caragana korshinskii into a good feed efficiently utilized by livestock.[Method]C.korshinskii was used as a single carbon source for screening medium and aniline blue screening medium was used to separate and screen out lignin degrading strain D11 from livestock manure and C.korshinskii humus.[Result] Strain D11 was identified by microbial morphology and 16S rDNA as Bacillus licheniformis，and the degradation conditions of D11 were optimized.The optimal degradation conditions of strain D11 were as follows：optimal nitrogen source was peptone，temperature was 28-32 ℃，pH was 7，the concentration of added inducer Mn2+ was 0.6 mmol/L.Under the optimal conditions，the degradation rate of strain D-11 to C.korshinskii lignin was 18.21%， the degradation rate of hemicellulose was 16.11%，the degradation rate of cellulose was 13.19%.[Conclusion] Strain D-11 can be used to ferment and degrade C.korshinskii，which can be transformed into an excellent feed utilized by livestock.

Key words Caragana korshinskii;Lignin;Lignindegrading bacteria;Screening;Fermentation and degradation;Optimization of degradation conditions

檸條是多年生豆科灌木，作為一種非競(jìng)爭性資源，在我國北方地區(qū)具有數(shù)量大、分布廣、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，由于其枝繁葉茂、營養(yǎng)豐富，含有10多種生物活性物質(zhì)，尤其是氨基酸含量豐富[1]，因此也是良好的飼用植物，但其木質(zhì)纖維素含量高，且收獲干燥后莖稈粗硬，并具有脫葉刺也成為影響牲畜對(duì)其高效利用的關(guān)鍵問題[2]。筆者從微生物豐富的糞便及其檸條腐殖質(zhì)中分離篩選出具有高效降解檸條木質(zhì)素的菌株，將檸條中難以被牲畜直接消化利用的木質(zhì)素，通過生物處理的方式降解為可被生物利用的小分子物質(zhì)，提高檸條的飼料營養(yǎng)價(jià)值和利用率，來發(fā)揮檸條潛在的飼用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及處理方法 試驗(yàn)所用樣品采自市區(qū)周邊郊區(qū)農(nóng)戶的牲畜糞便、腐質(zhì)檸條，分別裝入無菌袋帶回并保存于4 ℃冰箱中。

1.2 培養(yǎng)基

①初篩培養(yǎng)基。檸條粉10 g（檸條磨粉，過40目篩，65 ℃烘16 h），NH4NO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4 0.2 g，CaCl2 0.2 g，微量MnSO4·H2O，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L。②基本培養(yǎng)基（BM）。酵母膏10 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1L。③苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基。配制濃度為1.0%的苯胺藍(lán)（Azure-B）母液，在制作平板時(shí)，每100 mL 基本培養(yǎng)基（BM）中加入1.0 mL 母液即可。④LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。⑤液體發(fā)酵培養(yǎng)基。檸條粉10 g，蒸餾水1 L，自然pH，121 ℃滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 降解木質(zhì)素菌的篩選。

1.3.1.1 初篩。分別稱取各樣品10 g，搗碎后無菌水振蕩活化12 h，取上清液稀釋成10-4、10-5、10-6 濃度梯度的稀釋液，取0.1 mL 涂布到初篩培養(yǎng)基平板上，置于30 ℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)1～3 d，挑取能夠在初篩培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌菌株在LB 培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離、純化，最后保存在LB 斜面培養(yǎng)基上。

1.3.1.2 復(fù)篩。將初篩得到的菌株擴(kuò)培，轉(zhuǎn)接到BM培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，每株菌做2個(gè)平行。10 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液點(diǎn)樣于Azure-B 平板的微孔，每孔點(diǎn)樣100 μL。37 ℃避光培養(yǎng)2 d后，觀察并記錄脫色圈的有無及大小。

1.3.2 木質(zhì)素酶活力的測(cè)定方法。因?yàn)樗Y菌株未檢測(cè)漆酶活性，所以僅對(duì)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶進(jìn)行測(cè)定。制得菌株粗酶液后，按照Klopman等[3]和Heinfling等[4]的測(cè)定方法分別對(duì)木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（Mnp）活力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)。

將保存在LB斜面上的菌株轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以10%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)15 d。

1.3.4 檸條發(fā)酵產(chǎn)物中木質(zhì)纖維素各組分含量的測(cè)定。

發(fā)酵產(chǎn)物在121 ℃下滅菌30? min，過濾后收集殘?jiān)?，并在烘箱?5? ℃ 烘干至恒重，參照Van Soest等[5]的木質(zhì)纖維素測(cè)定方法對(duì)檸條發(fā)酵物中的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量進(jìn)行測(cè)定，以未發(fā)酵檸條粉為對(duì)照，計(jì)算出檸條中各組分的相對(duì)降解率。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 菌種鑒定。

將分離純化的菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d。利用引物27F和1492R擴(kuò)增所篩選微生物16S rDNA，送交測(cè)序公司測(cè)序后，將序列與NCBI網(wǎng)站登錄序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果及形態(tài)特征確定所篩選菌株的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解木質(zhì)素菌株的篩選

從樣品中共分離到木質(zhì)素降解菌31株，采用苯胺藍(lán)平板法初篩到具有水解透明圈的菌株12株。選取初篩菌株中水解圈直徑較大的前5株菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵上清液的水解圈大小，同時(shí)結(jié)合木質(zhì)素降解酶活力的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行復(fù)篩（表1）。從表1可以看出，以上菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基上產(chǎn)酶活力以菌株D-11、Y-1、S-3 較高。選取D-11 菌株進(jìn)行種屬鑒定及后續(xù)研究。

2.2 菌株D-11的16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將木質(zhì)素降解菌株D-11的16S rDNA序列經(jīng)測(cè)序獲得的序列在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST搜索和序列比對(duì)，結(jié)果顯示所獲得序列的同源性很高的序列大多來自芽孢桿菌屬（Bacillus）。根據(jù)16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹的遺傳距離分析（圖1），初步鑒定菌株D-11為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis strain）。

2.3 D-11菌株對(duì)檸條木質(zhì)素的降解率測(cè)定

對(duì)未發(fā)酵檸條粉和發(fā)酵15 d后檸條粉中木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，檸條粉經(jīng)菌株D-11發(fā)酵15 d后，對(duì)木質(zhì)素的降解率最高，達(dá)到10.12%;半纖維素和纖維素的降解率分別為9.63%和7.37%。這說明D-11對(duì)檸條木質(zhì)纖維素中各組分均具有一定的降解能力，尤其以木質(zhì)素的降解能力最好，與纖維素和半纖維素相比降解效果最為明顯。

2.4 木質(zhì)素降解條件的優(yōu)化

2.4.1 氮源的影響。

以檸條固定碳源，為發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.05%尿素、蛋白胨、硫酸銨以及硝酸鈉作為不同的氮源，接種D-11培養(yǎng)15 d后測(cè)定其各木質(zhì)素降解率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，選取的4種氮源中，D-11菌株對(duì)蛋白胨的利用較好，其降解能力較其他氮源總體上有所提升，使用硫酸銨以及硝酸鈉為氮源是對(duì)于木質(zhì)素降解率的提高不大，而以尿素為氮源時(shí)，其降解能力均有一定程度的下降。因此，蛋白胨為菌株D-11的適宜氮源。

2.4.2 溫度的影響。

從圖3可以看出，各組分降解能力所對(duì)應(yīng)的最適溫度范圍比較寬泛。木質(zhì)素與纖維素降解的最適溫度為32 ℃，但纖維素的降解在28～35 ℃內(nèi)變化不大;半纖維素的最適降解溫度為28 ℃，但在升溫至32 ℃過程中木質(zhì)素降解率的下降幅度并不大。各組分的降解能力在超過36 ℃時(shí)有明顯下降，究其原因可能是溫度的升高使降解酶的酶活發(fā)生變化，從而降低了木質(zhì)素的降解率。

2.4.3 pH的影響。

木質(zhì)素降解能力受培養(yǎng)液pH的影響較大。從圖4可以看出，當(dāng)培養(yǎng)液的pH為7時(shí)，木質(zhì)素、纖維素與半纖維素的降解能力均達(dá)到峰值。這說明中性環(huán)境對(duì)于D-11的產(chǎn)酶以及木質(zhì)素的降解更為有利，過高或者過低的pH都可能使菌株的生長發(fā)育產(chǎn)生了一定的消極影響，同時(shí)極端pH也會(huì)使降解所需酶失活變性，從而影響了木質(zhì)素的降解效率。D-11對(duì)于木質(zhì)素的降解在pH 為7時(shí)達(dá)到1293%，而纖維素的降解率在pH為6～8時(shí)變化幅度不大。

2.4.4 Mn2+濃度的影響。

菌株D-11的所產(chǎn)Mnp的酶活相對(duì)于S-3較弱，同時(shí)Mnp活性較為依賴Mn2+的濃度，所以添加一定濃度的Mn2+可以提高M(jìn)np的活力，從而提高木質(zhì)素的降解能力。從圖5可以看出，木質(zhì)素與纖維素降解率隨Mn2+濃度的增加而升高，但當(dāng)Mn2+濃度低于0.8 mmol/L時(shí)對(duì)木質(zhì)素與纖維素的降解有一定的促進(jìn)作用，但對(duì)半纖維素降解的影響較小，當(dāng)Mn2+濃度大于0.8 mmol /L 時(shí)菌株D-11對(duì)木質(zhì)纖維素的降解能力整體呈下降趨勢(shì)。這說明過量的Mn2+可能會(huì)變成毒性離子，會(huì)影響菌株的正常生長，將促進(jìn)作用轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

3 討論

目前，木質(zhì)素的生物質(zhì)降解利用主要集中在真菌與復(fù)合菌劑的研究，然而真菌雖然在降解效果上較為理想[6]，但其培養(yǎng)周期長，保存運(yùn)輸不便以及在飼料青貯過程中容易引起飼料變質(zhì)等問題也限制了其在生物質(zhì)降解利用方面的推廣。在針對(duì)木質(zhì)素降解菌的研究中發(fā)現(xiàn)許多可以降解木質(zhì)素的細(xì)菌，Bugg等[7]與Tuomela等[8]從造紙廠廢水中篩選出幾株芽孢桿菌，并在其細(xì)胞提取物中都分離出活性較高的木質(zhì)素降解酶。另外，Bandounas等[9]也成功分離出幾株可以降解堿性卡夫木質(zhì)素的芽孢桿菌。這些研究結(jié)果表明芽孢桿菌可能是木質(zhì)素降解中起到關(guān)鍵作用的微生物。該研究通過篩選成功分離到一株具有單獨(dú)降解檸條木質(zhì)素能力的地衣芽孢桿菌D-11，這對(duì)于檸條木質(zhì)素降解的研究具有一定的理論指導(dǎo)意義。

該研究采用單因素試驗(yàn)對(duì)氮源、溫度、pH以及誘導(dǎo)劑等影響木質(zhì)素降解的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，從而提高菌株D-11 對(duì)3種生物質(zhì)的降解能力， 在優(yōu)化條件下菌株D-11對(duì)檸條木質(zhì)素發(fā)酵15 d的降解率為18.21%，低于李紅亞等[10]采用細(xì)菌液態(tài)發(fā)酵玉米秸稈16 d后24% 的木質(zhì)素降解率。篩選菌株的木質(zhì)素降解率較低可能是由于多年生的平茬檸條木質(zhì)化程度高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一般作物秸稈中的木質(zhì)素含量，使相比更一般作物秸稈更難被降解;同時(shí)，該研究僅對(duì)部分發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，可能未達(dá)到菌株的最佳發(fā)酵條件。王仁佑等[11]研究表明金屬離子添加可以促使微生物的生長而提高產(chǎn)酶量，而且可以通過添加表面活性劑改變菌株細(xì)胞膜的通透性來提高胞外酶的分泌，促使微生物酶活的增加，提高木質(zhì)素降解能力[12]。因此，該研究下一步的研究重點(diǎn)是繼續(xù)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，考量其他誘導(dǎo)劑以及表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)酶和降解能力的影響，同時(shí)會(huì)研究多種微生物分部處理的生物預(yù)處理方法，加快降解速率并側(cè)重于實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的選擇性降解，從而達(dá)到檸條纖維素回收利用的目的，提高發(fā)酵飼料的營養(yǎng)價(jià)值。

4 結(jié)論

從檸條作為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基和苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基中分離出木質(zhì)素降解菌株D-11，經(jīng)過16S rRNA序列分析鑒定為地衣芽孢桿菌，對(duì)其采用優(yōu)化的降解條件：氮源為蛋白胨;溫度28～32 ℃;pH 為7;添加Mn2+的濃度為0.6 mmol/L進(jìn)行檸條發(fā)酵，其木質(zhì)素降解率為18.21%，半纖維素的降解率為16.11%，纖維素的降解率為13.19%，其中木質(zhì)素降解率較優(yōu)化前提高了79.94%。該研究結(jié)果為后續(xù)對(duì)檸條木質(zhì)素的降解研究提供更多試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]朱德文.農(nóng)作物秸稈用作動(dòng)物飼料——可行性與限制因素分析[J].飼料研究，2003（2）：34-36.

[2] 溫學(xué)飛，李明，黎玉瓊.檸條微貯處理及飼喂試驗(yàn)[J].中國草食動(dòng)物，2005，25（1）：56-57.

[3] KLOPMAN G，TU M H，F(xiàn)AN B T.Prediction of the metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons [J].Theor Chem Acc，1999，102：33-38.

[4] HEINFLING A，MARTINEZ M J，MARTINEZ A T，et al.Transformation of industrial dyes by manganese peroxidases from? Bjerkandera adusta and Pleurotus eryngii in a manganeseindependent reaction[J].Appl Environ Microbiol，1998，64（8）：2788-2793.

[5] VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A.Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition [J]. Journal of dairy science，1991，74（10）：3583-3597.

[6] 陳忠華.真菌降解木質(zhì)素的研究進(jìn)展及發(fā)展前景[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（9）：28-29.

[7] BUGG T D H，AHMAD M，HARDIMAN E M，et al.The emerging role for bacteria in lignin degradation and bio-product formation [J].Curr Opin Biotechnol，2011，22（3）：394-400.

[8] TUOMELA M，VIKMAN M，HATAKKA A，et al.Biodegradation of lignin in a compost environment：A review [J].Bioresour Technol，2000，72（2）：169-183.

[9] BANDOUNAS L，WIERCKX N J P，WINDE J H D，et al.Isolation and characterization of novel bacterial strains exhibiting lignin lytic potential [J].BMC Biotechnol，2011，11：1-11.

[10] 李紅亞，李術(shù)娜，王樹香，等.產(chǎn)芽孢木質(zhì)素降解菌MN-8的篩選及其對(duì)木質(zhì)素的降解[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（2）：324-333.

[11] 王仁佑，劉劍瀟，黃紅麗，等.鼠李糖脂對(duì)兩株木質(zhì)素降解菌產(chǎn)酶能力的影響[J].湖南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，35（10）：70-74.

[12] STOLZ A.Molecular characteristics of xenobioticdegrading sphingomonads [J].Appl Microbiol Biotechnol，2009，81：793-811.