申序 陳曉慧 徐小萍 霍雯 李曉斐 蔣夢(mèng)琦 張婧 林玉玲 賴鐘雄

摘 ?要??SET domain group（SDG）基因家族控制的組蛋白賴氨酸甲基化，是參與染色質(zhì)功能調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)的重要部分。為了解龍眼（DlSDG）家族的生物學(xué)功能，采用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行龍眼全基因組SDG家族成員的鑒定，并對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件、進(jìn)化樹(shù)、相關(guān)基因的蛋白互作和體胚發(fā)生早期的基因表達(dá)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果顯示，龍眼SDG家族基因包括32個(gè)成員，分為Suv、Ash、ATXR5/ATXR6、Trx、E（z）、SMYD和SETD 7個(gè)亞家族，其中Suv亞族成員數(shù)量最多;外顯子數(shù)量在1～22個(gè)不等，蛋白結(jié)構(gòu)域保守，都含有一個(gè)SET結(jié)構(gòu)域，DlSDG蛋白保守motif不同亞家族間差異較大;DlSDG啟動(dòng)子包含許多諸如低溫、干旱和壓力等非生物脅迫響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件;龍眼SDG成員在體胚發(fā)生早期均能不同程度表達(dá)，其中DlSUVR4b在EC和ICpEC階段可能發(fā)揮著較為重要的作用;DlSUVH4可以和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1發(fā)生互作。本研究表明，龍眼DlSDG32個(gè)組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因可能除了在生物鐘的調(diào)節(jié)、植物發(fā)枝數(shù)量、根的生長(zhǎng)發(fā)育、種子的萌發(fā)、花的發(fā)育和植株的形態(tài)建成等方面發(fā)揮重要功能外，也可能直接參與脅迫響應(yīng)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控，并且還可能在參與DNA甲基化、染色質(zhì)重塑的過(guò)程中形成體細(xì)胞胚胎發(fā)生的協(xié)作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)其具有功能上的多樣性、復(fù)雜性。

關(guān)鍵詞 ?龍眼;組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶;成員鑒定;功能分析;表觀遺傳中圖分類(lèi)號(hào)??S667.2??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Genome-wide Identification and Expression Analysis of SDG?Gene Family During Early Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.

SHEN Xu， CHEN Xiaohui， XU Xiaoping， HUO Wen， LI Xiaofei， JIANG Mengqi， ZHANG Jing， LIN Yuling， LAI Zhongxiong^*

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian?350002， China

Abstract ?The SET domain group （SDG） gene family controls histone lysine methylation， which is an important part of the regulation of chromatin function and epigenetic regulation of gene expression. To understand the biological function of longan （DlSDG） family， the wholeSDGfamily members of longan genome were identified by bioinformatics analysis， and the protein domain， conserved motif， gene structure， promoter homeopathic elements， evolutionary tree， protein interaction of related genes and gene expression at the early stage of somatic embryogenesis were predicted and analyzed. There were 32 members of longanDlSDGgene family， which could be divided into seven subfamilies，Suv，Ash，ATXR5/ATXR6，Trx，E（z），SMYDandSETD， andSuvhad the largest subfamily members. The number of exons varied from 1 to 22， and protein domains were conserved， all containing a SET?domain. DlSDG protein conserved motif had large differences among different subfamilies.DlSDGpromoters contained many abiotic stress response elements such as low temperature， drought， stress and hormone response elements.SDGmembers could be expressed to different degrees in the early stage of somatic embryogenesis.DlSUVR4bmight play an important role in EC and ICpEC stages. DlSUVH4 could interact with DNA methyltransferase MET1. The study showed that the longanDlSDG32 histone lysine methylation transferase genes maight directly involved in the regulation of stress response and somatic embryogenesis， possibly in DNA methylation， chromatin remodeling， formation in the process of somatic embryogenesis of collaborative control network in addition to the regulation of the circadian clock， branch number， root growth and development， seed germination， the growth of flowers and plants of morphogenesis with diversity and complexity.

Keywords ?longan; histone lysine methyltransferase; identification of members; functional analysis; epigenetic

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.002

在植物表觀遺傳學(xué)快速的發(fā)展背景下，植物組蛋白修飾作為重要的表觀遺傳調(diào)控手段已日益成為研究的熱點(diǎn)。組蛋白修飾同DNA甲基化、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控一樣是表觀遺傳調(diào)控的重要機(jī)制之一。真核生物中基因組DNA和組蛋白組裝在一起形成染色體。首先，組蛋白H2A、H2B形成二聚體，H3、H4形成四聚體，而染色質(zhì)的核心組成單位八聚體由2個(gè)H2A、H2B二聚體和1個(gè)H3、H4四聚體組成，經(jīng)146 bp的DNA纏繞形成染色體的基本組成單元核小體^[1-3]。作為調(diào)控核小體結(jié)構(gòu)的主要方式，組蛋白翻譯后修飾主要包括甲?；‵ormylation）、乙酰化（Acetylation）、甲基化（Methylation）、磷酸化（Phosphorylation）、泛素化（Ubiquity lation）、抑制基因表達(dá)的SUMO（small ubiquitin-like modifier modification，SUMOylation）化、ADP（ADP-ribosylation）核糖基化等修飾方式^[4-7]，且多發(fā)生在N端，多種組蛋白修飾結(jié)合與排列在一起構(gòu)成了組蛋白密碼^[8]，組蛋白與組蛋白、組蛋白與DNA的互作受到組蛋白密碼的影響從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)^[9]。組蛋白甲基化修飾是最為復(fù)雜的植物組蛋白修飾方式，表現(xiàn)出修飾位點(diǎn)多樣性和不同程度的修飾。植物組蛋白賴氨酸甲基化共價(jià)修飾主要依賴賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成，含有SET結(jié)構(gòu)域的SDG（SET domain group）是植物中唯一存在的具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白家族。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histone lysine mathylatransferases，HKMTs）是兩類(lèi)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的一大類(lèi)，在植物中共發(fā)現(xiàn)17個(gè)組蛋白賴氨酸甲基化位點(diǎn)和7個(gè)精氨酸甲基化位點(diǎn)。組蛋白甲基化常發(fā)生在組蛋白H3、H4的賴氨酸（K）和精氨酸（R）的殘基上，賴氨酸殘基上發(fā)生最為常見(jiàn)。組蛋白賴氨酸甲基化修飾主要通過(guò)改變賴氨酸殘基甲基化狀態(tài)和程度，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默與染色質(zhì)的活化而不改變修飾位點(diǎn)攜帶的電荷量，從而提高組蛋白疏水性，改變組蛋白分子內(nèi)部和分子間的相互作用，也可通過(guò)含有識(shí)別甲基化信號(hào)特定結(jié)構(gòu)域的閱讀器來(lái)實(shí)現(xiàn)^[10]。組蛋白賴氨酸甲基化可以發(fā)生單甲基化、雙甲基化和三甲基化3種不同程度的甲基化形式，其甲基化程度可以通過(guò)賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和賴氨酸去甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控維持動(dòng)態(tài)平衡^[10]。H3和H4組蛋白中分別有5個(gè)（K4、K9、K27、K36、K79）賴氨酸殘基和1個(gè)（K20）賴氨酸殘基可被甲基化。一般H3K4、H3K36和H3K79甲基化通常和參與基因轉(zhuǎn)錄的激活有關(guān)，H3K9、H3K27和H4K20甲基化則和參與基因的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)^[11]。

組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。組蛋白賴氨酸甲基化可以通過(guò)調(diào)控春化途徑從而參與開(kāi)花、促進(jìn)花粉發(fā)育的過(guò)程^[12-13];還可以參與啟動(dòng)植物種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)根的生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)生物鐘以及與擬南芥的發(fā)枝數(shù)量等^[14-17]。組蛋白賴氨酸甲基化能夠介導(dǎo)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與對(duì)體細(xì)胞胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控，并且植株的形態(tài)建成等完整生命過(guò)程均有組蛋白甲基化修飾的參與^[18]。此外，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶常通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)而參與各種脅迫應(yīng)答反應(yīng)。綜上，提示組蛋白賴氨酸甲基化幾乎參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的所有過(guò)程。

龍眼（Dimocarpus longanLour.）是我國(guó)重要的熱帶、亞熱帶常綠木本果樹(shù)，果實(shí)富含蛋白質(zhì)、氨基酸、類(lèi)黃酮和多酚多種物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值極高^[19]，其胚胎發(fā)育情況很大程度上影響果實(shí)產(chǎn)量、品質(zhì)和可食用率，但在龍眼生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中仍然存在核大、可食率低的問(wèn)題。賴鐘雄等^[20-21]以龍眼幼胚為材料建立了龍眼松散型胚性愈傷組織系，進(jìn)行長(zhǎng)期保持，并以此為基礎(chǔ)開(kāi)展了大量與龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)的研究。但在龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生的進(jìn)程中關(guān)于組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的研究未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)其他植物研究報(bào)道，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因MEA在胚胎和胚乳中表達(dá)，并通過(guò)基因組印跡參與胚胎和胚乳的發(fā)育^[22-23]。因此，鑒于SDG在高等植物尤其是木本果樹(shù)胚胎發(fā)育過(guò)程中潛在的生物學(xué)功能，進(jìn)一步的分析鑒定很有必要。在本實(shí)驗(yàn)室龍眼基因組破譯的基礎(chǔ)上，基于基因組開(kāi)展龍眼體胚發(fā)生早期組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族的生物學(xué)功能研究，不僅對(duì)龍眼生物技術(shù)的發(fā)展具有極大的意義，也對(duì)無(wú)患子科甚至所有木本植物體胚發(fā)生過(guò)程中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的研究具有重要借鑒意義。

1??材料與方法

1.1材料

采用本實(shí)驗(yàn)室最新精確組裝的龍眼基因組及全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（待發(fā)表）進(jìn)行分析。擬南芥（Arabidopsis thaliana）、甜橙（Citrus sinensis）基因序列、氨基酸序列下載于https：//phytozome.?html;水稻（Oryza sativa）氨基酸序列下載于Rice Annotation project Database（RAP-DB）^[24]。

1.2 方法

1.2.1 ?龍眼DlSDG基因家族成員鑒定??為對(duì)龍眼DlSDG家族進(jìn)行鑒定，首先選取模式植物擬南芥SDG氨基酸序列，經(jīng)龍眼數(shù)據(jù)庫(kù)同源比對(duì)，結(jié)合NCBI Blast分析，初步篩選確定37條具有完整開(kāi)放閱讀框的龍眼DlSDG候選序列。采用DNAMAN 6.0進(jìn)行g(shù)DNA、CDS、氨基酸序列比對(duì)，其中Dlo032596、Dlo027491注釋一樣，經(jīng)DNAMAN同源比對(duì)，Dlo032596、Dlo027491的CDS序列Identity為52.51%，氨基酸為42.38%，視為2條基因，分別命名為SUVH4a、SUVH4b;Dlo020952、Dlo020987的氨基酸同源比對(duì)顯示Identity為97.43%，CDS為97.96%，且5?端完全重合，選取Dlo020952進(jìn)行后續(xù)分析;Dlo014820、Dlo034485的氨基酸和CDS同源比對(duì)顯示Identity均為100%，后續(xù)選取Dlo014820進(jìn)行分析。結(jié)合SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和Pfam結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析和Softberry基因全長(zhǎng)預(yù)測(cè)分析，最終確定了龍眼基因組中存在32條DlSDG序列。

1.2.2 ?龍眼DlSDG基因染色體定位與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建??根據(jù)擬南芥SDG成員在龍眼基因組中的查找注釋，參考擬南芥的命名方法對(duì)龍眼DlSDG基因家族成員進(jìn)行命名。采用MEGA7的ClustalW對(duì)32個(gè)DlSDG基因家族成員氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，用進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建軟件的Neighbor-?joining method臨近法對(duì)龍眼、擬南芥、水稻、甜橙4個(gè)物種140條SDG基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)置為1000。采用TBtools^[25]進(jìn)行龍眼SDG基因染色體位置示意圖繪制。

1.2.3 ?龍眼DlSDG基因結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析??采用TBtools^[25]軟件，利用龍眼gff文件和genome文件對(duì)龍眼DlSDG家族32個(gè)成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析;采用ExPASy對(duì)32條DlSDG氨基酸序列進(jìn)行蛋白的等電點(diǎn)（pI）、分子量（Mw）、氨基酸數(shù)目等數(shù)據(jù)的分析;通過(guò)MEME（multiple expectation maximization for motif elicitafion）（http：//meme-suite.org/tools/meme）進(jìn)行龍眼DlSDG的保守基序分析，采用TBtools的可視化分析與motif圖片繪制。采用SMART和Pfam對(duì)龍眼DlSDG進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域在線預(yù)測(cè)，利用TBtools進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖繪制。

1.2.4 ?龍眼DlSDG啟動(dòng)子分析??采用TBtools進(jìn)行龍眼DlSDG基因起始密碼子ATG上游2000 bp序列的提取。采用PlantCARE（http：//bioinform a

tics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)分析龍眼DlSDG不同成員的啟動(dòng)子特征和順勢(shì)作用元件功能特點(diǎn)，采用TBtools進(jìn)行可視化繪圖。

1.2.5 ?龍眼DlSDG成員蛋白互作預(yù)測(cè)分析??利用STRING（https：//string-db.org）網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)、利用k均值聚類(lèi)算法進(jìn)行4個(gè)聚類(lèi)分析，選用研究最深入的擬南芥作為參考，最低互動(dòng)評(píng)分要求選擇highest confidence（0.900）探究DlSDG成員自身之間、與其他蛋白之間的互作情況。

1.2.6 ?龍眼DlSDG家族體胚發(fā)生早期階段表達(dá)分析??為更深入的了解DlSDG在體細(xì)胞胚胎和不同組織器官中可能具有的功能特點(diǎn)，利用龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)提取DlSDG基因在不同體胚發(fā)生階段胚性愈傷組織（EC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（IcpEC）、球形胚（GE）特異表達(dá)的FPKM值，分析家族各成員的表達(dá)情況。利用TBtools繪制表達(dá)熱圖。

2??結(jié)果與分析

2.1龍眼DlSDG家族基因鑒定與蛋白特性分析

在龍眼中獲得了32個(gè)SDG家族成員。通過(guò)NCBI Blast雙向比對(duì)，與模式植物擬南芥、單子葉子植物水稻和木本果樹(shù)甜橙家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，將其命名情況見(jiàn)表1。SDG家族蛋白特性分析發(fā)現(xiàn)，該基因家族氨基酸長(zhǎng)度相差較大，有336～2426?aa，大部分在1000 aa以下，蛋白分子量在36.33～275.37 ku之間，等電點(diǎn)（pI）為4.82～9.05（表1）。

2.2龍眼DlSDG家族基因染色體定位分析

DlSDG家族基因染色體定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族基因成員能精確定位在組裝好的染色體上，在龍眼基因組組裝好的15條染色體中，染色體3、10、12沒(méi)有DlSDG成員分布（圖1）。DlSDG基因在染色體上分布不均勻，其中1、5、6、7、9、13、15號(hào)染色體均分布3個(gè)以上的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員，以6號(hào)染色體最多，存在6個(gè)成員的分布，4、11、14號(hào)染色體最少，均只有1個(gè)成員分布。為分析DlSDG基因家族成員數(shù)量的龐大是否因?yàn)榛虻拇?lián)重復(fù)導(dǎo)致，參考Huang等^[26]的方法進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)分析，結(jié)果表明DlSDG家族成員無(wú)串聯(lián)復(fù)制現(xiàn)象存在（表1）。

2.3龍眼DlSDG基因結(jié)構(gòu)與蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為進(jìn)一步了解龍眼組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SDG基因家族成員的生物學(xué)功能，對(duì)32條基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行內(nèi)含子、外顯子的數(shù)目及位置進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果表明，所有SDG基因中有15條基因序列完整，具有基因結(jié)構(gòu)的上下游，4條基因序列具有上游或下游，13條序列缺少完整上下游。DlSDG內(nèi)含子數(shù)為1～22個(gè)之間，內(nèi)含子第1個(gè)均落在成熟編碼序列內(nèi)部，有利于將信號(hào)序列與編碼序列整齊地分開(kāi)。基因結(jié)構(gòu)圖明顯看出，龍眼賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SDG基因家族成員基因長(zhǎng)度存在較大的差異，可能是內(nèi)含子數(shù)量差異較大的原因，同時(shí)也可能影響其基因功能的分化。

為了解龍眼DlSDG基因家族的蛋白保守基序特點(diǎn)和分布情況，通過(guò)MEME軟件搜索出15個(gè)保守motif（圖2）。由圖2可知，整個(gè)龍眼SDG基因家族中最為保守的基序是motif2，所有32個(gè)成員中只有DlSUVH1缺少該保守基序，其次是motif1和motif3，均有27個(gè)成員具有這2個(gè)保守基序，大多數(shù)基因還具有motif4和motif7。進(jìn)化分析可以看出，同一個(gè)分支上的保守基序位置大致相同，這可能與它們功能的保守性有關(guān)。

SMART和Pfam蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析，DlSDG家族均屬于含SET結(jié)構(gòu)域超家族賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白?？傮w而言，DlSDG家族成員均至少含有1個(gè)SET結(jié)構(gòu)域，其中E（z）亞族的DlCLF蛋白最為特殊，含有3個(gè)SET結(jié)構(gòu)域，且為間斷排列，多數(shù)SET結(jié)構(gòu)域位于SET結(jié)構(gòu)域蛋白的末端，少數(shù)位于SET結(jié)構(gòu)域蛋白的前端和中部。圖3結(jié)構(gòu)域分析顯示，主要包括8個(gè)組別，分別為：含PreSET和SET結(jié)構(gòu)域的DlSUVH和DlSUVR;含有AWS、SET和PostSET的DlASHR3、DlASHH2，DlATXR7與其結(jié)構(gòu)域最為相似，歸為同一類(lèi);含有2個(gè)及以上PHD和1個(gè)SET結(jié)構(gòu)域的DlATX2、DlATX3、DlATX5;含有1個(gè)PHD和1個(gè)SET結(jié)構(gòu)域的DlATXR5;含有特殊SANT結(jié)構(gòu)域的DlSWN和DlCLF;2條含有AWS和SET的短序列DlASHH1和DlASHH3;只含有1個(gè)結(jié)構(gòu)域的DlASHR1、DlASHR2、DlATXR1、DlATXR2、DlATXR3、DlATXR4、DlSDG41和DlSETD10;以及含Rubis-subs-bind和SET的DlSDG40和DlSETD3。

2.4植物SDG家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

為更深入的了解龍眼DlSDG家族的生物學(xué)功能，采用MEGA7對(duì)擬南芥、水稻、甜橙和龍眼4個(gè)物種140條氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建（圖4）。參考擬南芥、水稻中基因的分類(lèi)，并結(jié)合聚類(lèi)分析，大致可以將龍眼DlSDG家族分為7類(lèi)。第1類(lèi)為Suv中的DlSUVH1、DlSUVH3、DlSUVH4a、DlSUVH4b、DlSUVH6、DlSUVH9以及DlSUVR2、DlSUVR3、DlSUVR4a、DlSUVR4b、DlSUVR5;第2類(lèi)為Ash中的DlASHH1、DlASHH2、DlASHH3、DlASHR3;第3類(lèi)主要包括DlATXR5;第4類(lèi)為T(mén)rx中的DlATX5、DlATX3和DlATX2;第5類(lèi)主要包括E（z）中的DlSWN和DlCLF;第6類(lèi)主要包括SMYD中的DlATXR1、DlATXR2、DlATXR3、DlATXR4、DlASHR2;第7類(lèi)主要為SET domain contain protein?（SETD），包括DlSDG41、DlSDG40和SETD3、SETD10。

2.5龍眼DlSDG基因家族啟動(dòng)子分析

為進(jìn)一步的分析龍眼DlSDG家族基因啟動(dòng)子的功能，通過(guò)PlantCARE在線預(yù)測(cè)分析DlSDG基因的啟動(dòng)子順式作用元件發(fā)現(xiàn)（圖5），DlSDG

家族成員啟動(dòng)子序列均含有較多的CAAT-box和TATA-box，說(shuō)明家族DlSDG基因均能進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄。所有龍眼DlSDG家族基因啟動(dòng)子含有較多的光響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，90%以上基因啟動(dòng)子含有茉莉酸甲酯激素應(yīng)答元件，50%基因啟動(dòng)子含有乙烯、水楊酸和赤霉素應(yīng)答元件，少數(shù)基因響應(yīng)脫落酸和生長(zhǎng)素應(yīng)答。此外，DlSDG家族基因還響應(yīng)低溫、干旱、脅迫、種子特異調(diào)控和胚乳表達(dá)元件，提示DlSDG家族基因可能在抗逆、耐寒、種子生長(zhǎng)和胚胎成熟發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

2.6龍眼DlSDG家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

利用String蛋白互作在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)32個(gè)DlSDG蛋白成員之間的功能關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)（通過(guò)擬南芥與甜橙、楊樹(shù)互作結(jié)果比對(duì)，選擇研究較為深入的擬南芥作為模式植物，圖6）。蛋白互作聚類(lèi)預(yù)測(cè)顯示，綠色和黃色區(qū)域的蛋白質(zhì)間互作關(guān)系強(qiáng)，SDG家族除自身成員之間會(huì)發(fā)生互作之外，還會(huì)與其他蛋白互作。SDG家族主要有ASHH1、EFS（ASHH2）、ATXR5、ATXR6互作和SWN、CLF、MEA之間的互作。說(shuō)明這兩組基因之間功能的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)。

2.7龍眼DlSDG家族基因組織特異表達(dá)分析

結(jié)合龍眼3代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)注釋中不同體胚發(fā)生階段的FPKM值，制作聚類(lèi)分析熱圖（圖7）。結(jié)果表明：在不同體胚發(fā)生過(guò)程中，大致有4種表達(dá)模式：GE階段上調(diào)，EC和ICpEC階段下調(diào)（DlSUVH4b、DlATXR7、DlSWN、DlCLF）;EC階段上調(diào)，GE和ICpEC階段下調(diào)（DlASHH2、DlATXR2、DlASHR2、DlSDG40）;ICpEC階段上調(diào)，GE和EC階段下調(diào)（DlSUVH1、DlSUVH3、DlSUVH9、DlSUVH4a、DlSUVR5、DlASHR3、DlATX2、DlATXR5）;EC和ICpEC階段上調(diào)，GE階段下調(diào)（DlSUVH6、DlSUVR2、DlSUVR3、DlSUVR4a、DlSUVR4b、DlASHR3、DlATX2、DlASHH2、DlATXR4、DlASHR1、DlATXR1、DlASHH1、DlSETD10、DlSETD3、DlSDG41）?？傊?，龍眼賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族在體胚發(fā)生不同階段均發(fā)生不同程度的表達(dá)，總體來(lái)看，與EC和ICpEC階段相比，大部分龍眼SDG家族成員在GE中表達(dá)較低，其中DlSUVR4b在EC和ICpEC中出現(xiàn)高表達(dá)，DlCLF較EC和ICpEC相比，在GE中高表達(dá)，可能預(yù)示著DlSUVR4b在EC和ICpEC中、DlCLF在GE中發(fā)揮著較為重要的作用。

3??討論

3.1龍眼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員可能具有功能上的多樣性

組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)組蛋白的賴氨酸甲基化共價(jià)修飾的完成，絕大多數(shù)含有一個(gè)具有甲基轉(zhuǎn)移活性，130～150個(gè)氨基酸的SET保守結(jié)構(gòu)域。在擬南芥、水稻和玉米中至少有47、37和35個(gè)SDG基因^[27]，其他在葡萄和楊樹(shù)中有報(bào)道^[28-29]，關(guān)于無(wú)患子科植物組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG家族的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。系統(tǒng)進(jìn)化分析將含有SET結(jié)構(gòu)域的龍眼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因分為7個(gè)大類(lèi)。鑒定龍眼基因組有32個(gè)完整SET結(jié)構(gòu)域的SDG成員，少于擬南芥的47個(gè)、水稻的35個(gè)，可能是因?yàn)?em>DlSDG在龍眼基因組中無(wú)串聯(lián)重復(fù)或染色體片段復(fù)制導(dǎo)致的基因復(fù)制相對(duì)較少有關(guān)。與之前的研究相似，系統(tǒng)發(fā)育分析將龍眼SDG基因分為了7個(gè)主要的類(lèi)群^[27，30]（圖4）。近年來(lái)的研究揭示，擬南芥組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶ATX1可通過(guò)調(diào)節(jié)水楊酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號(hào)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子WRKY70啟動(dòng)子的H3K4的甲基化，來(lái)激活WRKY70，進(jìn)而上調(diào)水楊酸信號(hào)途徑基因PR1的表達(dá)以及下調(diào)茉莉酸信號(hào)途徑基因THI2.1的表達(dá)，參與到擬南芥對(duì)假單胞菌（PstDC3000）侵染的防御反應(yīng)^[31-32]。植物病原抵御基因能夠被轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)志H3K36me3修飾誘導(dǎo)并大量表達(dá)，從而抵御病菌的侵害^[33]。也有研究顯示ASHH2通過(guò)介導(dǎo)ERF1、MYC2、PDF1.2a和VSP2等JA/ET信號(hào)途徑基因位點(diǎn)，誘導(dǎo)這些基因的快速轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)擬南芥對(duì)真菌（黑斑病菌和灰霉病菌）的抗性^[33]。這些研究表明H3K36甲基化修飾正調(diào)控植物對(duì)細(xì)菌及真菌的防御反應(yīng)。在龍眼中沒(méi)有鑒定出ATX1基因，但鑒于SDG亞族間功能上有冗余性的特點(diǎn)，龍眼中與ATX1結(jié)構(gòu)域相似的DlATX2、DlATX3和DlATX5具有同DlASHH2一樣抵御病原菌侵害的潛在功能。SDG基因還參與了花粉的發(fā)育、根的生長(zhǎng)發(fā)育、種子萌發(fā)、生物鐘的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程^[14-17]和控制擬南芥根尖分生組織和靜止中心的細(xì)胞分裂^[34]。

結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域分析，龍眼SDG同其他植物一樣都具有保守的SET結(jié)構(gòu)域。E（z）亞家族在擬南芥中包括CURLYLEAF（CLF）、MEDEA（MEA）和SWINGER（SWN）3個(gè)成員，除SET結(jié)構(gòu)域外，還含有SWl3、ADA2、NCoR、TFIIIBDNA. Binding（SANT）和cysteine. rich（CXC）2種結(jié)構(gòu)域，龍眼E（z）家族的DlSWN和DlCLF 2個(gè)成員均含有SANT結(jié)構(gòu)域，只有DlCLF還含有CXC，可能龍眼dlswn與擬南芥atswn功能存在差異。Trx亞家族中ATXR7不含有除SET和PostSET以外的結(jié)構(gòu)域，其他成員的PHD結(jié)構(gòu)域是一類(lèi)含類(lèi)C4HC3型鋅指基序結(jié)構(gòu)域的統(tǒng)稱，具有與DNA、RNA、蛋白質(zhì)、組蛋白共價(jià)修飾等多種生物大分子結(jié)合的能力，同一個(gè)蛋白質(zhì)上的不同PHD結(jié)構(gòu)域，甚至同一PHD結(jié)構(gòu)域的不同基序都可能具有識(shí)別不同生物大分子的功能^[35];PWWP結(jié)構(gòu)域可以特異地與甲基化的賴氨酸殘基結(jié)合^[36];可能龍眼中DlATX2、DlATX3、DlATX5具有識(shí)別生物大分子并結(jié)合形成復(fù)合物發(fā)揮相關(guān)功能。此外FYRN和FYRC結(jié)構(gòu)域存在于染色質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)中，具體功能未知^[37]，DlATX2具有完整的FYRN和FYRC結(jié)構(gòu)域，暗示其可能與染色質(zhì)生物學(xué)功能有關(guān)。Suv亞家族是SDG中最大的亞族，可以細(xì)分Suvhomologs（SUVH）亞族和Suv-related homolog（SUVR）亞族。SUVH亞族成員含有一個(gè)保守的SET和RING finger associated（SRA）結(jié)構(gòu)域，可以特異地與DNA序列中甲基化的胞嘧啶結(jié)合^[38]，暗示龍眼DlSUVH可能與DNA甲基化共同參與某一生物學(xué)問(wèn)題。研究證明SMYD亞家族的AtASHRl與H3K4me2甲基化相關(guān)^[39]，研究認(rèn)為SETD亞家族成員不作用于組蛋白的甲基化^[27]。

3.2龍眼DlSDG可能影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的進(jìn)程

在植物中，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶直接參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究報(bào)道很少。已見(jiàn)報(bào)道E（z）家族的MEA在胚胎和胚乳中表達(dá)，參與胚胎和胚乳的發(fā)育。對(duì)于同亞族SWN，有報(bào)道稱萌發(fā)后的clf和swn雙突變體中有LEC1異位表達(dá)^[40]。也有報(bào)道表明SWN與MEA存在功能冗余，SWN突變?cè)鰪?qiáng)了MEA突變體的胚胎致死性^[41]。SWN可能抑制與胚胎發(fā)生無(wú)關(guān)的基因，并且是營(yíng)養(yǎng)階段抑制LEC1的重要因子。在鑒定的龍眼組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SDG家族中，存在2個(gè)E（z）家族成員DlSWN和DlCLF成員，且在龍眼早期胚胎發(fā)生GE階段上調(diào)表達(dá)，表明龍眼DlSWN和DlCLF可能直接參與植物體細(xì)胞胚胎發(fā)育進(jìn)程。

組蛋白修飾酶是參與染色質(zhì)重塑最重要的因子^[42]。在擬南芥中，已經(jīng)證實(shí)了染色質(zhì)重塑與體細(xì)胞胚胎之間發(fā)生的關(guān)系，據(jù)報(bào)道，一種染色質(zhì)重塑因子PICKLE（PKL）影響胚胎特異性基因的表達(dá)，如擬南芥中的LEC1^[43]。許多研究報(bào)道證明，組蛋白甲基化在表觀遺傳控制基因的表達(dá)和染色質(zhì)重塑與包裝方面發(fā)揮著重要的作用^[44]，尤其是在分化方面^[45]。越來(lái)越多證據(jù)表明植物體胚發(fā)生過(guò)程中基因表達(dá)的時(shí)空特異性除了受特異的DNA序列控制，一定程度的DNA甲基化有利于植物體細(xì)胞胚胎的正常發(fā)育^[46]。對(duì)擬南芥MET和CMT3（維持甲基化酶）無(wú)效等位基因的突變體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其胚胎無(wú)法正常發(fā)育且生活力下降，且胚胎發(fā)育相關(guān)的基因未出現(xiàn)表達(dá)，說(shuō)明DNA甲基化對(duì)擬南芥的胚胎發(fā)生起著非常關(guān)鍵的作用^[47]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，H3K9甲基化對(duì)DNA甲基化是必須的，對(duì)擬南芥kyp（suvh4）突變株功能分析證實(shí)了這一關(guān)系，和cmt3的突變體相似，kyp突變體中CNG區(qū)域的DNA甲基化水平降低^[48]，表明CMT3介導(dǎo)的DNA甲基化位于H3K9甲基化的下游。另外的研究表明CMT3的Chromo結(jié)構(gòu)域可以與K9和K27同時(shí)被甲基化的組蛋白H3K9K27的N-端結(jié)合^[49]，表明H3K9和H3K27甲基化可能共同形成了被CMT3識(shí)別的信號(hào)導(dǎo)致CNG的甲基化。這些研究表明，組蛋白賴氨酸轉(zhuǎn)移酶可能通過(guò)參與染色質(zhì)重塑和DNA甲基化來(lái)影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生基因的表達(dá)，從而對(duì)體細(xì)胞胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程產(chǎn)生重要的影響。在龍眼基因組中鑒定出32個(gè)組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，表達(dá)分析提示組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶可能在參與DNA甲基化和染色質(zhì)重塑與組裝的過(guò)程中對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的進(jìn)程產(chǎn)生重要的影響，也可能通過(guò)形成DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑更為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同參與體細(xì)胞胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)也顯示出SDG家族成員MEA、CLF、SWN、SUVH4與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1之間具有互作關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶可能通過(guò)與DNA甲基化和染色質(zhì)重塑關(guān)聯(lián)參與植物體細(xì)胞胚胎調(diào)控。

3.3龍眼DlSDG可能響應(yīng)非生物脅迫

龍眼SDG家族順勢(shì)作用元件分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，除DlSUVH3、DlSUVH4a、DlSUVR3、DlSUVR4b、DlASHR3、DlATXR2、DlATXR5、DlSWN、DlASHH3、DlASHR1、DlASHH1、DlASHR2、DlSETD3、DlSDG40、DlSDG41以外啟動(dòng)子均含有低溫響應(yīng)元件，9個(gè)成員DlSUVH1、DlSUVR2、DlSUVR4a、DlSUVR4b、DlASHR3、DlATXR7、DlATX3、DlATXR1、DlASHH1預(yù)測(cè)到干旱脅迫響應(yīng)元件，還有DlSUVH1、DlSUVH3、DlSUVH9、DlSUVR3、DlSUVR4a、DlASHR3、DlASHH2、DlATXR2、DlASHR1、DlATXR1、DlASHH1、DlSDG40、DlSDG41、DlSETD3共14個(gè)成員具有抵御和壓力脅迫響應(yīng)元件，預(yù)示龍眼中SDG家族可能與龍眼干旱、低溫和鹽脅迫等非生物脅迫響應(yīng)有關(guān)。組蛋白賴氨酸甲基化共價(jià)修飾在響應(yīng)低溫、干旱脅迫、鹽脅迫和生物脅迫等方面具有一定的作用，而與高溫脅迫響應(yīng)無(wú)密切關(guān)系^[50]。在干旱條件下，ABA合成關(guān)鍵酶NINE-CIS-EPOXYCAROTENOIDDIOXYGENASE3（IVCED3）基因座能特異結(jié)合ATX1，上調(diào)其表達(dá)，ABA依賴的干旱響應(yīng)信號(hào)通路被啟動(dòng);同時(shí)也上調(diào)表達(dá)RESPONSIVETODESICCATION?29A（RD29A）和RD29B等基因，參與其他干旱響應(yīng)信號(hào)通路^[51-52]。多次干旱處理，RD29B和RESPONSIVETOABA18（RABl8）等基因的基因座上H3K4me3水平在水分充足的情況下同樣維持在較高水平，表明ATXl參與了干旱脅迫的記憶過(guò)程^[53]。CLF引導(dǎo)的H3K27me3同樣參與了干旱脅迫過(guò)程，但并不形成脅迫記憶^[54]。龍眼SDG中未能鑒定到ATX1賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因，有一個(gè)CLF基因，鑒于同一家族結(jié)構(gòu)保守和可能存在功能冗余性，除上述具有干旱、低溫和壓力脅迫響應(yīng)的基因外，龍眼SDG家族中DlATX2、DlATX5和DlCLF也可能具有抗旱、抗寒和耐鹽脅迫的潛在功能。此外，ASHH2也被證明在重復(fù)的機(jī)械刺激造成的對(duì)觸碰誘導(dǎo)基因TOUCH3（TCH3）的脅迫記憶中發(fā)揮作用^[55]，順式作用響應(yīng)元件分析表明，龍眼DlASHH2可能具有這方面的功能。

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