呂玲玲 馮雪鋒 李可 李威

摘 ?要??咖啡堿-輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl-CoA-O methyltransferase， CCoAOMT）是木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶，但其在逆境脅迫中也發(fā)揮重要作用。根據(jù)茄子基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物克隆了CCoAOMT，命名為SmCCoAOMT，其最大閱讀框?yàn)?64 bp，編碼187個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為20.95 ku。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)SmCCoAOMT與其他植物的CCoAOMT序列同源性高達(dá)90.67%，同時(shí)具有CCoAOMT的全部保守序列。對(duì)其在不同果皮顏色茄子品種及35 ℃高溫下果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR分析，結(jié)果表明SmCCoAOMT在果皮顏色深的茄子品種中的相對(duì)表達(dá)量高于在果皮顏色淺的品種中的表達(dá)量，說明SmCCoAOMT的表達(dá)量與茄子果色呈正相關(guān);與常溫對(duì)照相比，在花后10和20 d時(shí)，高溫脅迫下SmCCoAOMT的表達(dá)量都顯著下降，尤其是在花后10 d時(shí)，表達(dá)量僅為對(duì)照的9.23%，說明SmCCoAOMT表達(dá)量顯著下調(diào)可能是導(dǎo)致果皮顏色變淺的原因之一。結(jié)果推測(cè)SmCCoAOMT在高溫脅迫下茄子果皮顏色變淺的過程中起正調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞 ?茄子;SmCCoAOMT;高溫脅迫;果皮著色中圖分類號(hào)??S641.1??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

SmCCoAOMT?Positively Regulates the Peel Coloring in Eggplant under High Temperature Stress

LYU?Lingling¹， FENG Xuefeng²， LI Ke³， LI Wei³

1. Huaihua University， Huaihua， Hunan 418008， China; 2.?Shangqiu University， Shangqiu， Henan 476000， China; 3. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial Key Laboratory for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract ?Caffeoyl-CoA-O methyltransferase （CCoAOMT） is a key enzyme in the lignin synthetic pathway and also plays an important role in abiotic stresses. According to the eggplant reference genome，SmCCoAOMTwas cloned from eggplant. The maximum?opening reading frame （ORF） ofSmCCoAOMTwas 564 bp， encoding 187 aa and its relative molecular weight was 20.95 ku. The bioinformation analysis indicated thatSmCCoAOMT showed 90.67% sequence identity withCCoAOMTs of other plants and had all the conservative sequences inCCoAOMT.The expressions in eggplants with different peel colors and at different stages of fruit development were analyzed by qRT-PCR. The results showed that the expression ofSmCCoAOMTwas significantly higher in purplish red and blackish purple peels than in white and green peels， which was positively correlated with peel color. Comparing to control， on the 10^thand 20^thdays after flowering （10DAF， 20DAF）， the expressions ofSmCCoAOMTwere significantly down-regulated under high temperature （HT） stess， especially on 10DAF， the expression decreased to 9.23%. Which might lead to the light peel color. The results suggested thatSmCCoAOMT positively regulated the peel coloring in eggplant under HT stress.

Keywords ?eggplant;SmCCoAOMT; high temperature stess; peel coloring

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.025

茄子（Solanum melongena L.），茄科茄屬類蔬菜，起源于印度，中國為第2起源地^[1]。茄子在我國南北均大面積栽培，但各地喜好的果形和顏色變化較大：在東北以綠色卵茄為主，華東地區(qū)主要是紫紅線茄，在中原地區(qū)，主要以綠長茄為主，西南地區(qū)以紫茄為主，華南地區(qū)主要栽培紫紅長茄^[2]。因此，果皮顏色成為茄子重要的育種目標(biāo)之一。茄子果皮著色的最佳溫度為20～25?℃，華南地區(qū)5—6月份的高溫天氣易造成茄子果皮顏色變淺甚至完全變白、著色不均勻等問題^[3-4]，嚴(yán)重影響了茄子的外觀品質(zhì)，同時(shí)降低了茄子的商品價(jià)值。

咖啡堿-輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl-CoA-?O methyltransferase， CCoAOMT）屬于植物氧甲基轉(zhuǎn)移酶I類，此類蛋白的氨基酸序列有8個(gè)保守的基序，其中基序A[（V/I/L）（V/L）（D/K）（V/I）GG XX（G/A）]、B[（V/I/F）（A/P/E）X（A/P/G）DAXXXK（W/?Y/F）]、C[（A/P/G/S）（L/I/V）（A/P/G/S）XX（A/P/G/S）?（K/R）（V/I）（E/I）（L/I/V）]是植物氧甲基轉(zhuǎn)移酶所共有，其余5個(gè)為CCoAOMT所特有^[5]，這類酶的相對(duì)分子量較小。CCoAOMT為木質(zhì)素合成過程中的關(guān)鍵酶，參與植物的木質(zhì)化進(jìn)程。CCoAOMT基因在植物抵御生物、非生物脅迫過程中也發(fā)揮重要作用。西瓜在干旱脅迫下CCoAOMT蛋白表達(dá)上調(diào)^[6]。玉米在干旱條件下CCoAOMT的活性被激活，表明木質(zhì)素的生物合成與植物抗旱性強(qiáng)弱有關(guān)^[7]。煙草^[8]、水稻^[9]、擬南芥^[10]、龍眼^[11]中CCoAOMT在調(diào)控植物對(duì)干旱、低溫或高鹽等逆境脅迫的生理適應(yīng)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期研究中（文章未發(fā)表），帶花蕾的茄子植株經(jīng)35?℃高溫（High temperature，HT）處理后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)高溫下SmCCoAOMT在果實(shí)發(fā)育過程中顯著下調(diào)表達(dá)，果皮顏色與常溫對(duì)照（CK）相比也變淺，說明SmCCoAOMT與果皮著色密切相關(guān)。本文的目的是想闡明SmCCoAOMT在高溫下茄子果皮著色中的作用，為全面了解高溫下茄子果皮著色機(jī)理打下基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1材料

以田間篩選出來的高溫條件下果皮顏色變淺的紫紅長茄30#為材料。在相同栽培管理?xiàng)l件下，選取大小一致的植株20株，在授粉當(dāng)天，高溫處理（35?℃?12 h/25?℃?12 h）下培養(yǎng)10株，對(duì)照（CK）（25?℃?12 h/20?℃?12 h）條件下10株，12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)。分別于開花后10、15、20 d（day after flowering， 10DAF， 15DAF， 20DAF）采樣，削取茄子果皮，每個(gè)樣3次重復(fù)，共計(jì)18個(gè)樣，液氮速凍后?80?℃保存，作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料，同時(shí)用于基因表達(dá)分析。另外在田間種植4個(gè)不同果色的茄子品種：19#（白色果皮）、30#（紫紅果皮）、49#（綠色果皮）、59#（紫黑果皮），取成熟果實(shí)的果皮，3次重復(fù)，用于基因的表達(dá)分析。

1.2方法

1.2.1SmCCoAOMT的克隆??用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAout 2.0試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)為CAT#： 90404-50）來提取茄子果皮的總RNA，對(duì)RNA進(jìn)行純度和濃度檢測(cè)后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）合成cDNA第1鏈，作為隨后PCR擴(kuò)增的模板。根據(jù)茄子基因組數(shù)據(jù)（http：//eggplant.kazusa.or.jp/），利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)SmCCoAOMTcDNA全長擴(kuò)增引物，QC-F：5?-ATGACCACCTCTGCCGATGAAG-3?，QC-R：5?-TTAACTGATGCGGCGACAAAGA-3?。反應(yīng)體系為：PCR緩沖液12.5 μL，8.4 μL滅菌去離子水，0.1 μLTaq酶，正向、反向引物各1 μL（10 μmol/L），cDNA模板2 μL;PCR擴(kuò)增條件為：94?℃變性3 min;94?℃變性0.5 min，58?℃退火0.5 min，72?℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán);72?℃延伸10 min。將目的片段連接到pMD19-T上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性克隆送華大基因測(cè)序。

1.2.2SmCCoAOMT的生物信息學(xué)分析??從NCBI上選取馬鈴薯、辣椒、番茄、煙草、可可樹、茄子等植物的CCoAOMT氨基酸序列，利用DNAMAN軟件分析其同源性。利用ClustalX?2與MEGA5軟件和Neighbor-Joining方法構(gòu)建茄子SmCCoAOMT與NCBI中已經(jīng)登錄的高等植物的CCoAOMT進(jìn)化樹。

1.2.3SmCCoAOMT的表達(dá)分析??以18s?rRNA為內(nèi)參基因^[12]，對(duì)SmCCoAOMT基因在不同果皮顏色茄子品種及果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析。定量取出1 ?g RNA，使用TaKaRa定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA用作定量表達(dá)的模板。SmCCoAOMT定量表達(dá)的引物，dl-up：GGTGGGCTAATTGGCTATGA，dl-dn：AGGAAGCTGGCAGATTTCAA。反應(yīng)體系：95?℃?30 s，1個(gè)循環(huán);95?℃?5 s，55?℃?30 s，72?℃?30?s，40個(gè)循環(huán)。如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后再添加一個(gè)溶解曲線的反應(yīng)：95?℃?60 s，58?℃?30 s，95?℃?30?s，1個(gè)循環(huán)。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncant檢驗(yàn)。

2??結(jié)果與分析

2.1SmCCoAOMT cDNA全長克隆及其生物信息學(xué)分析

通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定，得到SmCCoA OMT基因cDNA全長（圖1），其最大閱讀框?yàn)?64 bp，編碼187個(gè)氨基酸（圖2），相對(duì)分子質(zhì)量為20.95 ku。

2.2SmCCoAOMT的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN對(duì)馬鈴薯、辣椒、番茄、煙草、可可樹、茄子等植物CCoAOMT氨基酸序列的同源性進(jìn)行分析（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)茄子CCoAOMT與其他物種的CCoAOMT序列同源性高達(dá)90.67%，與馬鈴薯的同源性最高。同時(shí)茄子SmCCoAOMT具有CCoAOMT的全部保守序列（紅色方框標(biāo)示）。

利用ClustalX?2與MEGA5軟件和Neighbor-?Joining方法構(gòu)建茄子SmCCoAOMT與NCBI中部分高等植物的CCoAOMT進(jìn)化樹，結(jié)果顯示：茄子與甜椒、馬鈴薯最先歸為一類，親緣關(guān)系較近，其次是葡萄、煙草與矮牽牛，而與毛白楊的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4）。

2.3SmCCoAOMT的表達(dá)分析

2.3.1SmCCoAOMT在不同果色茄子品種中的表達(dá)??SmCCoAOMT在紫黑果皮59#品種中表達(dá)量最高，其次是紫紅果皮30#品種，在綠色果皮49#和白色果皮19#中的表達(dá)量顯著低于前2個(gè)品種（圖5），即在顏色深的茄子品種中的相對(duì)表達(dá)量高于在顏色淺的茄子品種中的表達(dá)量，說明SmCCoAOMT的表達(dá)量與茄子果色呈正相關(guān)。

2.3.2SmCCoAOMT在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)??常溫下，SmCCoAOMT在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量呈先降后升的趨勢(shì);高溫下SmCCoAOMT的表達(dá)量在果實(shí)發(fā)育的3個(gè)時(shí)期變化不大，但與常溫對(duì)照相比，在10DAF和20DAF時(shí)，其表達(dá)量都顯著下降，尤其是在10DAF時(shí)，表達(dá)量僅為常溫對(duì)照的9.23%。在果實(shí)發(fā)育早期，SmCCoAOMT表達(dá)量的顯著下調(diào)可能是導(dǎo)致果皮著色不良的原因之一。

3??討論

在茄科蔬菜苯丙烷類代謝過程中，含苯丙烷骨架的物質(zhì)，如綠原酸、木質(zhì)素、花青素、原花青素等都是以苯丙氨酸為合成前體^[13]。此代謝途徑有2大分支，都是以肉桂酸、香豆酸為中間產(chǎn)物，一類是在查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的作用下進(jìn)入花青素合成途徑，另一類則是在CCoAOMT的作用下進(jìn)入木質(zhì)素合成途徑（圖7），CHS和CCoAOMT就成了進(jìn)入這2個(gè)途徑的關(guān)鍵酶。

CCoAOMT所介導(dǎo)的甲基化反應(yīng)使花青素酚羥基的反應(yīng)活性降低、穩(wěn)定性增強(qiáng)，使花青素不斷積累，使花、果實(shí)等組織呈現(xiàn)各種不同的顏色^[15]。

紅色方框內(nèi)為植物CCoAOMT的保守序列元件。

Red-boxes are popular conserved sequence elements in plant?CCoAOMTs.

NP001305508.1：?Solanum tuberosum; AAF44689.1：?Populus tomentosa; APX43200.1：Populus tomentosa; XP002298729.1：Populus trichocarpa; ALR35193.1：Fraxinus mandshurica; PON82039.1：Trema orientale; BAE48788.1：Codonopsis lanceolata; XP017233504.1：Daucus carotasubsp. sativus; XP012831062.1：Erythranthe guttata; AAT75320.2：Boehmeria nivea; AAS91565.1：Broussonetia papyrifera; XP006856484.1：Amborella trichopoda; AFD23679.1：Salvia miltiorrhiza; XP007047308.1：Theobroma cacao; XP010263488.1：Nelumbo nucifera; XP010270267.1：Nelumbo nucifera; XP002282867.1：Vitis vinifera; XP016561061.1：Capsicum annuumvar. grossum; ALP75647.1：?Petunia ×?hybrid; XP019251878.1：Nicotiana attenuata; AFS33547.1：Nicotiana tabacum

李曉峰等^[16]的研究發(fā)現(xiàn)，CCoAOMT的上調(diào)表達(dá)會(huì)使‘碭山酥梨果皮由黃綠色變成褐色;psCC oA OMT是引起?果實(shí)褐變的主要基因之一^[17];將PhCCoAOMT1轉(zhuǎn)入只開白花的‘Mitchell矮牽牛品種中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片變紫，花色由白色變成粉紅色^[18]。本次研究中，SmCCoAOMT在顏色深的茄子品種中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于在顏色淺的茄子品種中的表達(dá)量;在高溫脅迫下的果

NP001305508.1：?Solanum tuberosum; AAF44689.1：?Populus tomentosa; APX43200.1：Populus tomentosa; XP002298729.1：Populus trichocarpa; ALR35193.1：Fraxinus mandshurica; PON82039.1：Trema orientale; BAE48788.1：Codonopsis lanceolata; XP017233504.1：Daucus carotasubsp.sativus; XP012831062.1：Erythranthe guttata; AAT75320.2：Boehmeria nivea; AAS91565.1：Broussonetia papyrifera; XP006856484.1：Amborella trichopoda; AFD23679.1：Salvia miltiorrhiza; XP007047308.1：Theobroma cacao; XP010263488.1：Nelumbo nucifera; XP010270267.1：Nelumbo nucifera; XP002282867.1：Vitis vinifera; XP016561061.1：Capsicum annuumvar. grossum; ALP75647.1：?Petunia ×?hybrid; XP019251878.1：Nicotiana attenuata; AFS33547.1：Nicotiana tabacum.

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Different lowercase letters indicate a significant difference determined by the Duncan test （P<0.05）.

實(shí)發(fā)育過程中，SmCCoAOMT表達(dá)量下降，茄子果皮顏色也變淺，推測(cè)SmCCoAOMT是影響茄子果色形成的關(guān)鍵基因之一。Sugar等^[19]的研究認(rèn)為，在梨果實(shí)發(fā)育過程中，一旦受到逆境脅迫，CCoAOMT表達(dá)量就會(huì)下降，導(dǎo)致果實(shí)表皮細(xì)胞

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

Different lowercase letters indicate a significantdifference （P<0.05）.

CHI： Chalcone isomerase; CHS： Chalcone synthase; PAL： Phenylalanine ammonialyase; DFR： Dihydroflavonol reductase; F3H： Flavanone 3-hydroxylase; ANS： Anthocyanidin synthase.

老化，果肉細(xì)胞增大不一致，使氣孔保衛(wèi)細(xì)胞破裂后形成的空洞內(nèi)產(chǎn)生次生保護(hù)組織，導(dǎo)致細(xì)胞壁增厚，外層細(xì)胞破損，進(jìn)而形成果點(diǎn)，造成果皮木栓化，從而引起果皮顏色變淺、有斑點(diǎn)、著色不均勻。本研究結(jié)果與其結(jié)果一致，但其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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