劉超，景贊，黃志勇

（樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川樂山 614000）

醬油，作為一種富有營(yíng)養(yǎng)和特殊香味的調(diào)味品，是目前最常見的家庭調(diào)料。醬油在制作過程中會(huì)發(fā)生美拉德（Maillard）反應(yīng)，即還原糖與氨基酸反應(yīng)，烯醇式Amadori重排產(chǎn)物在1，2 位置烯醇化并消去C3 上的羥基，加H2O生成3-脫氧己糖酮，然后脫水生成5-羥甲基糠醛類風(fēng)味成分[1-5]。

5-羥甲基糠醛對(duì)眼、黏膜、皮膚有刺激性，過量食用會(huì)引起中毒，造成動(dòng)物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害[6]。目前對(duì)醬油中5-羥甲基糠醛含量的檢測(cè)主要有液相色譜法[7]、紫外分光光度法[8]等，這些方法因靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性等原因，很難滿足醬油中5-羥甲基糠醛的準(zhǔn)確測(cè)定。本試驗(yàn)使用了液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法檢測(cè)醬油中5-羥甲基糠醛，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在國內(nèi)尚屬首次。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，99.9%，HPLC/ACS 級(jí)，北京市百靈威科技有限公司；甲酸純度≥88%，HPLC 級(jí)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯，99.9%，HPLC/ACS 級(jí)，J&K SCIENTIFIC LTD；5-羥甲基糠醛，99.0%，化學(xué)試劑，Sigma 公司，批號(hào)C16308402。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18，（3.9 mm×150 mm，5/um)；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：0.05%甲酸；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。梯度洗脫程序如表1 所示。

1.4 質(zhì)譜條件

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：DGU-20A-API3200。質(zhì)譜參數(shù)：采用ESI 源正離子掃描模式，離子源參數(shù)見表2。掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），監(jiān)測(cè)參數(shù)如表3 所示。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution procedure

表2 質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrum condition

表3 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Table 3 Multi-reaction monitoring parameters

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取10 mg 的5-羥甲基糠醛至10 mL 容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4 ℃下避光儲(chǔ)存。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的制備

吸取1 mL 儲(chǔ)備液至10 mL 容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，配成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.5.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

稱取2 g 陰性樣品于塑料離心管中，加入0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.25 mL 標(biāo)準(zhǔn)液，加入10 mL 乙酸乙酯，以180 r/min 振蕩10 min，超聲提取10 min（功率700 W），搖勻。以4 000 r/min 離心5 min，取上清液至25 mL容量瓶中，按上述方法再提取1 次，上清液轉(zhuǎn)移至同一25 mL 容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。將陽離子交換柱連接至固相萃取裝置，依次用3 mL 甲醇和3 mL水活化，移取5 mL 樣液至此陽離子交換柱中，流速控制在1 mL/min，用5 mL 水淋洗，抽干，用5%氨化甲醇洗脫，流速控制在1 mL/min，收集洗脫液。洗脫液經(jīng)40 ℃氮吹至干，用甲醇定容至1.0 mL，配成0、0.25、0.5、1.0、2.0、4、5 μg/mL 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

引言:當(dāng)前,經(jīng)濟(jì)生活水平的提高,人們開始更注重身體保健,所以通過定期體檢盡早發(fā)現(xiàn)疾病并加以治療[1]。采血作為體檢中的項(xiàng)目之一,體檢人員基于對(duì)體檢認(rèn)知的不足以及采血后按壓手法的不當(dāng),采血后皮下血腫問題明顯,造成體檢人員身體、心理一定程度傷害,還會(huì)導(dǎo)致醫(yī)療糾紛問題[2]。護(hù)理干預(yù)工作的實(shí)施可以降低體檢人員采血期間皮下血腫問題,利于提高體檢人員的滿意度[3]。基于此,本文就我院體檢中心160例體檢人員作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,總結(jié)護(hù)理干預(yù)價(jià)值。

1.6 樣品制備

1.6.1 提取

稱取2 g 醬油樣品于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 乙酸乙酯，以180 r/min 振蕩10 min，超聲提取10 min（功率700 W），搖勻。以4 000 r/min 離心5 min，取上清液至25 mL 容量瓶中，按上述方法再提取1 次，上清液轉(zhuǎn)移至同一25 mL 容量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，待凈化。

1.6.2 凈化

將陽離子交換柱連接至固相萃取裝置，依次用3 mL甲醇和3 mL 水活化，移取5 mL 樣液至此陽離子交換柱中，流速控制在1 mL/min，用5 mL 水淋洗，抽干，用5%氨化甲醇洗脫，流速控制在1 mL/min，收集洗脫液。洗脫液經(jīng)40 ℃氮吹至干，用甲醇定容至1.0 mL，過0.22 μm微孔濾膜，濾液供上機(jī)分析。

1.7 檢出限與定量限

稱取2 g 陰性樣品按照1.6 的方法制備700 W，搖勻。以4 000 r/min 離心5 min，取上清液至空白溶液。用空白樣品溶液將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋至產(chǎn)生3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比（S/N）。根據(jù)色譜圖得信噪比，按S/N=3：1 和S/N=10：1 計(jì)算檢出限和定量限。

1.8 方法的準(zhǔn)確性

低濃度加標(biāo)回收水平：稱取2 g 陰性樣品于50 mL塑料離心管中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按1.6 操作，配置成0.125 mg/kg 的質(zhì)控樣品。

中濃度加標(biāo)回收水平：稱取2 g 陰性樣品于50 mL塑料離心管中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按1.6 操作，配置成0.50 mg/kg 的質(zhì)控樣品。

高濃度加標(biāo)回收水平：稱取2 g 陰性樣品于50 mL塑料離心管中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按1.6 操作，配置成2.0 mg/kg 的質(zhì)控樣品。

1.9 精密度

稱取2 g 陰性樣品于50 mL 塑料離心管中，加入0.0125 mL 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，按1.6 操作，連續(xù)進(jìn)樣6 針，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，以確定儀器精密度。

1.10 方法的重復(fù)性

取濃度為0.25、0.5、1.0 mg/kg 的質(zhì)控樣品，各3 份，經(jīng)1.6 處理后上機(jī)分析，測(cè)得峰面積，代入隨行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度及RSD，即得重復(fù)性結(jié)果，以確定方法重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 5-羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of 5-hydroxymethylfurfural

圖1 為5-羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從圖1 可以看出，5-羥甲基糠醛在0～5 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)R2=0.999 7＞0.99，表明5-羥甲基糠醛在上述范圍線性良好，故選取0～5 μg/mL 為試驗(yàn)的線性范圍。

2.2 檢出限和定量限

由圖2～4 可以看出，選擇m/z127.0 為5-羥甲基糠醛離子，選擇碎片離子中響應(yīng)值較高的3 個(gè)碎片離子m/z109.4、81.3 和53.3 作為定性和定量離子，此方法可有效避免假陽性。

圖2 5-羥甲基糠醛一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of 5-hydroxymethylfurfural

圖3 5-羥甲基糠醛二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS2 spectra of 5-hydroxymethylfurfural

圖4 5-羥甲基糠醛對(duì)照品色譜圖Fig.4 Chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural

2.3 方法的準(zhǔn)確性

采用空白樣品加標(biāo)回收法測(cè)定該方法的準(zhǔn)確性[9-10]。由表4 可以看出，5-羥甲基糠醛在高、中、低三個(gè)水平的回收率為81.4%～93.3%。低濃度回收率略低，且回收率隨著濃度的增大而升高，在不同濃度下的回收率均滿足要求。

表4 不同濃度下的5-羥甲基糠醛回收率（n=3）Table 4 Recoveries of 5-hydroxymethylfurfural at different concentration levels（n=3）

2.4 方法的重復(fù)性

表5 不同濃度下5-羥甲基糠醛的重復(fù)性（n=3）Table 5 Repeatability of 5-hydroxymethylfurfural at different concentration levels（n=3）

如表5 所示，在不同濃度下該方法重復(fù)性RSD均小于5%，表明該方法在低、中、高三水平下重復(fù)性良好。

2.5 精密度

5-羥甲基糠醛精密度測(cè)量結(jié)果為0.535 0、0.512 5、0.540 0、0.520 0、0.527 5、0.5075，RSD＜2.43%，這表明儀器精密度良好，在此濃度下可取得良好精密度。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)醬油中5-羥甲基糠醛的方法，并考察了其方法學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示，該方法經(jīng)乙酸乙酯提取、強(qiáng)陽離子固相萃取柱凈化、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了醬油中5-羥甲基糠醛的快速檢測(cè)。該方法檢出限為0.60 mg/kg，加標(biāo)濃度在0.125、0.50 和2.0 mg/kg 水平下的平均回收率為81.4%～93.3%；該水平下重復(fù)性RSD＜5%；精密度RSD＜3%。該方法具有操作簡(jiǎn)單、科學(xué)合理、定性定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于醬油中5-羥甲基糠醛的測(cè)定。