武藝秀 郁征宇 葛晨輝 王全華 蔡曉鋒

摘 要： 在菠菜全基因組中鑒定了菠菜（Spinacia oleracea L.）乙醇酸氧化酶（GLO）家族成員，并對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、同源關(guān)系及基因表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)菠菜中存在5個(gè)SoGLOs蛋白，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析，菠菜GLO蛋白與甜菜GLO蛋白親緣關(guān)系較近.通過(guò)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該家族基因由9～11個(gè)外顯子構(gòu)成.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （qRT-PCR） 結(jié)果表明：硝態(tài)氮僅能短期誘導(dǎo)SoGLOs的表達(dá)，而銨態(tài)氮可以持續(xù)抑制SoGLOs的表達(dá)，從而影響菠菜草酸的含量.在脅迫處理后，SoGLOs的表達(dá)均有明顯變化，SoGLO1，SoGLO3和SoGLO5對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)最明顯，SoGLOs可能在菠菜的抗鹽、耐高溫、耐寒、抗旱以及抗氧化過(guò)程中起作用.植物激素的噴施普遍使SoGLOs的表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)增加，這可能引起菠菜體內(nèi)草酸的快速積累.

關(guān)鍵詞： 菠菜（Spinacia oleracea L.）; 乙醇酸氧化酶（GLO）; 逆境脅迫; 基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： S 636.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)： 1000-5137（2019）05-0557-09

Abstract： The spinach （Spinacia oleracea L.） glycolate oxidase （GLO） gene family members were identified from the whole genome of spinach，and their physical and chemical properties，subcellular localization，gene structure，conserved motifs，homology and gene expression were analyzed.Results showed that there are five SoGLOs proteins in spinach.The genetic relationship between spinachs GLO protein and those of Beta vulgaris L. protein was relatively close through phylogenetic tree analysis.Gene structure analysis revealed that the family gene consisted of 9 to 11 exons.Real-time quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） showed that nitrate nitrogen could only induce SoGLOs expression in a short period of time，while ammonium nitrogen could continue to inhibit the expression of SoGLOs，thus affecting the content of spinach oxalic acid.After stress treatment，the expression of SoGLOs changed significantly.SoGLO1，SoGLO3 and SoGLO5 responded most to salt stress.SoGLOs may play a role in the salt tolerance，high temperature tolerance，cold tolerance，drought resistance and antioxidant process of spinach.Spraying of phytohormones generally increases the expression of SoGLOs in a short period of time，which may cause rapid accumulation of oxalic acid in spinach.

Key words： spinach （Spinacia oleracea L.）; glycolate oxidase （GLO）; abiotic stresses; gene expression

0 引 言

植物會(huì)被各種病原體（包括病毒、細(xì)菌和真菌）感染，為應(yīng)對(duì)病原體入侵，植物會(huì)產(chǎn)生許多應(yīng)激反應(yīng)來(lái)防御.對(duì)病原體感染最早的細(xì)胞反應(yīng)之一就是快速產(chǎn)生活性氧（ROS），如過(guò)氧化氫（H2O2）或超氧陰離子（O2-）[1].在感染后，由NADPH氧化酶誘導(dǎo)使植物中ROS快速增加，其催化O2轉(zhuǎn)化為超氧陰離子（O2-）.另一種產(chǎn)生ROS的途徑是由乙醇酸氧化酶（GLO）介導(dǎo)的.GLO是光呼吸途徑的關(guān)鍵酶之一，以黃素單核苷酸（FMN）為輔基的黃素依賴(lài)蛋白，能調(diào)節(jié)綠色植物中活性氧介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2].光呼吸過(guò)程中，乙醇酸從葉綠體轉(zhuǎn)入過(guò)氧化物酶體，由GLO催化氧化成乙醛酸和過(guò)氧化氫.由于在光呼吸中執(zhí)行了導(dǎo)致能量損失的關(guān)鍵步驟，因此它一直是作物改良的目標(biāo)蛋白.除了在光呼吸作用中具有代謝功能外，GLO還可以在植物的光合作用調(diào)節(jié)和抗逆性中發(fā)揮作用.抑制GLO基因會(huì)導(dǎo)致乙醛酸積聚并抑制光合作用，而過(guò)表達(dá)GLO基因則可在強(qiáng)光和高溫下提高水稻的光合作用[3].GLO已被證明參與植物對(duì)病原體的防御[4].植物對(duì)病原體的成功抗性反應(yīng)常表現(xiàn)為過(guò)敏反應(yīng)（HR），這是一種細(xì)胞程序性死亡，發(fā)生在病原體與植物相互作用的部位周?chē)?，這種細(xì)胞死亡可能也是由ROS生成引發(fā)的.西紅柿光呼吸GLO產(chǎn)生的H2O2有助于防御丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae） [5].GLO的反應(yīng)及產(chǎn)生的過(guò)氧化氫對(duì)植物適應(yīng)干旱、鹽害、重金屬等非生物脅迫具有重要作用，并且對(duì)植物非寄主抗病性起重要調(diào)控作用.

GLO不僅能夠催化乙醇酸氧化成乙醛酸，還能催化乙醛酸氧化生成草酸[6].CHANG等[7]研究表明GLO影響植物體內(nèi)草酸鹽的積累和調(diào)節(jié).YU等[8]研究指出：光呼吸途徑中的乙醛酸確實(shí)是草酸合成的有效前體物質(zhì).草酸在植物體中廣泛存在，起著調(diào)節(jié)植物pH值，緩解重金屬毒害，誘導(dǎo)抗病性，以及調(diào)節(jié)Ca2+濃度等作用.然而草酸會(huì)引起人體腎結(jié)石、高草酸血癥等疾病.菠菜是一種高草酸含量的蔬菜，減少其草酸含量有助于提高其食用價(jià)值.

GLO是光呼吸途徑的關(guān)鍵酶之一，對(duì)于減少菠菜中草酸的生成以及提高抗逆、抗病性有重要意義.本研究對(duì)菠菜GLO家族成員進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析，并研究了供氮形態(tài)、環(huán)境脅迫及植物激素對(duì)GLO基因表達(dá)的影響.

1 材料與方法

1.1 菠菜GLO蛋白的鑒定

在擬南芥種質(zhì)信息（TAIR）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org）中獲得擬南芥AtGLOs（Glycolateoxidase）蛋白序列，在菠菜數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.spinachbase.org/？q=blast）中進(jìn)行TBLASTN分析，得到菠菜GLO基因候選序列，同時(shí)對(duì)所獲得的序列開(kāi)放閱讀框（ORF）.經(jīng)篩選后的氨基酸序列再利用ScanProsite軟件（https：//prosite.expasy.org/scanprosite/）和InterProScan軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）來(lái)驗(yàn)證.

1.2 基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守序列及進(jìn)化樹(shù)分析

利用基因核苷酸編碼序列與其相對(duì)應(yīng)的基因組序列，通過(guò)Gene Structure Display Server（GSDS2.0，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）確定其基因結(jié)構(gòu).利用ExPaSy（http：//web.expasy.org/protparam）預(yù)測(cè)氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn).使用MEGA7繪制進(jìn)化樹(shù)（NJ tree）.利用MEME Suite（http：//meme.sdsc.edu/meme/memeintro.html/）進(jìn)行蛋白保守基序（motif）分析.在線使用WoLF PSORT（http：//wolfpsort.hgc.jp/）對(duì)其蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位.

1.3 菠菜材料的處理與采樣

供氮處理的實(shí)驗(yàn)材料為S14（高草酸積累型菠菜）和S104（低草酸積累型菠菜），來(lái)自上海師范大學(xué)植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心.將種子播種于穴盤(pán)，以體積比例為1∶1的草炭土/珍珠巖為基質(zhì)，在玻璃溫室中育苗.

水培：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗洗去根部基質(zhì)，移至營(yíng)養(yǎng)液（大量元素采用Hoagland配方，微量元素采用Arnon配方）中進(jìn)行水培，營(yíng)養(yǎng)液每3 d進(jìn)行1次更換，并且每天對(duì)其pH值進(jìn)行測(cè)量與調(diào)節(jié)，使其保持在5.8～6.0之間，水培菠菜置于人工氣候室中，光照周期為10 h（光照）/14 h（黑暗），溫度控制在21 ℃（光照）/18 ℃（黑暗），光照強(qiáng)度約為5 000 lx，濕度控制在71%左右.

盆栽：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗連同基質(zhì)移栽至培養(yǎng)缽中，放入托盤(pán)并從底部澆水，盆栽菠菜置于人工氣候室培養(yǎng)，條件與水培菠菜相同.

培育2周后，再次選取長(zhǎng)勢(shì)一致的菠菜苗，進(jìn)行后期處理.

供氮處理?xiàng)l件（水培）：15 mmol·L-1 NO3-;15 mmol·L-1 NH4+;7.5 mmol·L-1 NH4NO3;正常營(yíng)養(yǎng)液配方（CK）.采樣時(shí)間：經(jīng)過(guò)0，3，6，12，24 h分別采樣1次.

植物激素及抗壞血酸處理?xiàng)l件（盆栽）：噴施100 mmol·L-1 脫落酸（ABA）;赤霉素（GA）;乙烯利（ETH）;吲哚乙酸（IAA）;茉莉酸甲酯（Me-JA）;水楊酸（SA）;6-芐基胺基嘌呤（6-BA）;抗壞血酸（AsA）;對(duì)照（H2O）.使用噴壺對(duì)地上部分進(jìn)行噴灑直至有水珠從葉片下滴.采樣時(shí)間：經(jīng)過(guò)0，3，6，12 h分別采樣一次.

環(huán)境脅迫處理?xiàng)l件（盆栽）：模擬干旱（澆灌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% 的PEG8000）;鹽脅迫（澆灌400 mmol·L-1 NaCl）;氧化脅迫（噴施100 mmol·L-1 H2O2）;高溫脅迫（40 ℃）;低溫脅迫（4 ℃）.采樣時(shí)間：經(jīng)過(guò)0，3，6，12 h分別采樣一次.

1.4 GLOs基因表達(dá)分析

使用Trizol法提取菠菜總核糖核酸（RNA），并使用NanoDropTM OneC分析RNA的濃度與質(zhì)量.通過(guò)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（complementary DNA）模板.使用Primer-BLAST（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）進(jìn)行引物設(shè)計(jì).使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM （Tli RNaseH Plus）試劑盒在ABI7500上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）.采用So18s基因作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，用GraphPad Prism 7對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖.

2 結(jié) 果

2.1 菠菜SoGLO家族成員全基因組鑒定

在菠菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中利用4個(gè)擬南芥AtGLO蛋白序列進(jìn)行TBLASTN分析，經(jīng)過(guò)保守序列確認(rèn)得到5個(gè)菠菜SoGLOs蛋白.將這5個(gè)蛋白基因分別命名為SoGLO1，SoGLO2，SoGLO3，SoGLO4，SoGLO5.SoGLO5相對(duì)分子質(zhì)量為2.595×104，等電點(diǎn)為5.73，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)在線粒體、葉綠體和細(xì)胞核.基因信息如表1所示.

菠菜SoGLOs基因的外顯子數(shù)量為9～11個(gè)（圖1），其中SoGLO1含有11個(gè)外顯子，SoGLO2和SoGLO3都含有10個(gè)外顯子，SoGLO4和SoGLO5含有9個(gè)外顯子、8個(gè)內(nèi)含子.

2.2 菠菜SoGLO家族蛋白保守基序分析

利用Pfam對(duì)菠菜GLO蛋白序列進(jìn)行分析，SoGLOs屬于FMN-dependent dehydrogenase家族.MEME對(duì)菠菜5個(gè)GLO蛋白序列進(jìn)行分析，共鑒定了8個(gè)保守基序（圖2）.

這些motifs的分布如圖3所示：每個(gè)GLO蛋白中的motif數(shù)量在5～8之間，其中motif 1，motif 2，motif 3存在于所有蛋白中，其中motif 6都位于C末端.

2.3 菠菜和其他植物GLO蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

將SoGLOs與擬南芥、水稻、苜蓿、甜菜的部分GLO氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，初步構(gòu)建了NJ進(jìn)化樹(shù)（圖4）.結(jié)果顯示：SoGLO2與BvGLO1同源，相似度達(dá)99%;SoGLO3與BvGLO4同源，相似度98%;SoGLO1，SoGLO4與SoGLO5聚為一類(lèi)，與BvGLO1.2，BvGLO4.2，BvGLO5同源，SoGLO1與BvGLO1.2相似度為90%，SoGLO4與BvGLO4.2相似度為98%.

2.4 供氮形態(tài)對(duì)菠菜GLOs表達(dá)的影響

SoGLO1在供氮處理24 h時(shí)均上調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)在銨態(tài)氮供給的104號(hào)材料中持續(xù)表現(xiàn)為下調(diào).SoGLO2 在供氮處理1 h時(shí)均上調(diào)，在24 h的銨態(tài)氮供給條件下上調(diào)，而在24 h硝態(tài)氮供給時(shí)下調(diào).SoGLO3 在104號(hào)材料各處理的1 h和3 h時(shí)上調(diào)，在同時(shí)供給硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的情況下上調(diào)最高.SoGLO4 的表達(dá)模式和SoGLO3 類(lèi)似.SoGLO5 在24 h供給硝態(tài)氮時(shí)下調(diào)，而在其他條件下下調(diào)（圖5）.

2.5 環(huán)境脅迫對(duì)菠菜GLOs表達(dá)的影響

SoGLO1，SoGLO3 和SoGLO5 對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)最明顯，都呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)水平，其中SoGLO1的表達(dá)在鹽脅迫12 h時(shí)達(dá)到對(duì)照的5.03倍.高溫脅迫SoGLO2 和SoGLO5 的表達(dá)模式類(lèi)似，都在1 h達(dá)到最高，隨后逐漸降低，12 h降至低于對(duì)照水平（圖6）.

2.6 植物激素及抗壞血酸對(duì)菠菜GLOs表達(dá)的影響

3 h和6 h時(shí)GA處理下的SoGLOs 均有小幅上調(diào).6-BA處理1 h時(shí)，SoGLO1 和SoGLO3 均有明顯上調(diào)，隨后下降（圖7）.

3 討 論

光呼吸是指植物的綠色細(xì)胞在光照下吸收氧氣釋放二氧化碳的反應(yīng).GLO蛋白是光呼吸代謝中的重要酶，并且一直被認(rèn)為在調(diào)控光合作用中有重要作用.此外GLO基因的表達(dá)會(huì)影響草酸的積累，光呼吸乙醇酸途徑是草酸合成的主要途徑之一.水稻基因組中預(yù)測(cè)有5個(gè)GLO基因.OsGLO1和OsGLO4主要在水稻葉片中表達(dá)，具有酶活（性）;OsGLO3主要在水稻根中表達(dá)，具有酶活;OsGLO5主要在水稻根中表達(dá)，不具有酶活;OsGLO1，OsGLO3和OsGLO4可以相互作用.水稻中GLO同工酶，受到OsGLO1和OsGLO4協(xié)同調(diào)控[9].浮萍中的草酸可以在沒(méi)有GLO/光呼吸的黑暗或愈傷組織中積累[10].水稻中，草酸的積累并不依賴(lài)于光呼吸中的GLO，GLO對(duì)草酸的積累沒(méi)有貢獻(xiàn)[11]，但光呼吸途徑中的乙醛酸確實(shí)是草酸合成的有效前體物質(zhì).

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同供氮形態(tài)下菠菜SoGLOs基因的表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)：合成草酸的GLO在低草酸積累型菠菜提供銨態(tài)氮時(shí)的表達(dá)量都有所下調(diào)，但都在24 h時(shí)回升，其中SoGLO1最為明顯;在完全硝態(tài)氮供給時(shí)，僅在1 h時(shí)出現(xiàn)上調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)的變化都不明顯.由此推斷，硝態(tài)氮僅能短期誘導(dǎo)SoGLOs的表達(dá)從而在短期內(nèi)提高菠菜草酸的合成，而銨態(tài)氮可以持續(xù)抑制SoGLOs的表達(dá)，從而降低菠菜草酸的含量.高草酸積累型菠菜在銨態(tài)氮供給下，SoGLO2表達(dá)量在3～12 h時(shí)顯著下調(diào)，說(shuō)明銨態(tài)氮能抑制SoGLO2 的表達(dá)，而在24 h時(shí)表達(dá)量升高至12 h的3倍多，說(shuō)明高草酸積累型菠菜通過(guò)提高SoGLO2表達(dá)量來(lái)增加草酸積累.在硝態(tài)氮銨態(tài)氮等比例供給條件下，SoGLO3表達(dá)量在高草酸積累型菠菜中變化不大，而在低草酸積累型菠菜中隨時(shí)間逐步下降，24 h時(shí)表達(dá)量下降到不足原來(lái)的1/3，說(shuō)明低草酸積累型菠菜通過(guò)顯著抑制SoGLO3基因表達(dá)量來(lái)降低草酸含量.在低草酸積累型菠菜中，SoGLO4表達(dá)量在硝態(tài)氮供給時(shí)隨時(shí)間逐步下降，6 h時(shí)約下降為原來(lái)的1/3，而在硝態(tài)氮銨態(tài)氮等比例供給時(shí)，3 h時(shí)約下降為原來(lái)的1/3，說(shuō)明銨態(tài)氮會(huì)迅速抑制SoGLO4基因的表達(dá).已經(jīng)有一些氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)植物體內(nèi)草酸含量影響的研究.不同供氮水平會(huì)對(duì)植物草酸含量有顯著影響.燈籠甜椒的草酸含量會(huì)隨著供氮水平的提高而增加，高氮處理比低氮處理要高9倍[12].不同供氮形態(tài)也會(huì)影響植物草酸含量.西紅柿的葉片、葉柄、莖，和根在供給硝態(tài)氮條件下草酸含量最高，供給尿素草酸含量次之，供給銨態(tài)氮草酸含量最低.西紅柿葉片草酸含量供給硝態(tài)氮條件下比供給銨態(tài)氮高了5.1倍[13].水稻在硝態(tài)氮供給條件下可以誘導(dǎo)草酸的合成，在亞硝態(tài)氮供給條件下對(duì)草酸含量無(wú)顯著影響，而供給其他氮源如銨態(tài)氮、尿素會(huì)降低草酸的含量[14].

隨著GLO的表達(dá)增加，在將乙醇酸氧化為乙醛酸的同時(shí)，生成了更多的H2O2.H 2O2能作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)相關(guān)反應(yīng)，來(lái)應(yīng)對(duì)逆境脅迫.GLO的表達(dá)增加，也會(huì)使植物草酸含量增加，草酸可以提高植物抗脅迫能力.草酸的合成可能是控制菠菜應(yīng)激反應(yīng)的一部分，其中相關(guān)基因的表達(dá)也能從一定層面上解釋菠菜面對(duì)非生物脅迫時(shí)的反應(yīng)機(jī)理.在高溫脅迫下，與草酸合成相關(guān)的GLO基因SoGLO2，SoGLO4，SoGLO5的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯的升高，這可能意味著在高溫脅迫下菠菜草酸的合成主要依賴(lài)于GLO進(jìn)行.SoGLO1，SoGLO3 和SoGLO5 對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)最明顯，都呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)水平.干旱脅迫下SoGLO3和SoGLO5表達(dá)模式相似，1 h時(shí)表達(dá)升高，隨后降低;6 h后表達(dá)水平升高.氧化脅迫下，SoGLO3和SoGLO5表達(dá)量先下降后升高，可能在氧化脅迫中起重要作用.在擬南芥細(xì)胞中草酸在臭氧誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用[15].GLO催化生成的草酸可能是氧化脅迫誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一部分，觸發(fā)了程序性細(xì)胞死亡，從而提高植物抗逆性.低溫脅迫下SoGLO2和SoGLO5都有顯著變化，這2個(gè)基因可能與植物抗低溫有重要關(guān)系.于婷婷[16]的研究指出，過(guò)量表達(dá)GLO基因的擬南芥在 NaCl 和 Mannitol 處理下的主根長(zhǎng)度均高于對(duì)照，在 H2O2處理下的生長(zhǎng)狀況及葉片褪綠情況均好于對(duì)照，說(shuō)明GLO能夠在一定程度上提高擬南芥植株對(duì)鹽、干旱及氧化脅迫的抗逆性.抗旱型小麥在干旱脅迫下旗葉和穗部GLO活性分別上升了42.3%和5.9%[17].GLO 在植物抗逆中發(fā)揮著重要作用.

植物激素的噴施普遍在短時(shí)間內(nèi)引起GLO表達(dá)量的變化，1 h 6-BA，GA和IAA處理下的SoGLO1，SoGLO2和SoGLO3表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)，并在之后迅速回歸正常水平，這可能是引起草酸加速積累的原因之一.SA處理后SoGLO2，SoGLO3，SoGLO4，SoGLO5表達(dá)先下降后升高.ABA處理后SoGLO2的表達(dá)變化最大，其表達(dá)水平在3 h時(shí)升至最高.植物激素可以通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育.人參根中PgGLO 在ABA 和SA處理1 h后表達(dá)量上調(diào) 2.94倍和2.03倍，在隨后48 h內(nèi)表達(dá)量有下降，但都高于對(duì)照組[18].施用植物激素能引起GLO的表達(dá)量的變化，從而調(diào)控草酸的合成.

4 結(jié) 論

對(duì)菠菜基因組中鑒定出的5個(gè)GLO蛋白基因進(jìn)行了基因結(jié)構(gòu)、保守基序和進(jìn)化關(guān)系分析.并且研究了不同供氮形態(tài)、環(huán)境脅迫和施用植物激素條件下菠菜SoGLO基因的表達(dá)情況.結(jié)果表明：供氮形態(tài)和施用激素會(huì)影響SoGLO的表達(dá)從而影響菠菜草酸的含量，菠菜SoGLO可能在抗鹽、耐熱、耐寒、抗旱以及抗氧化脅迫中起作用.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）