徐兆豐 蔣鈺玉 靳羽嘉 李靜

摘 要： 通過克隆形成能力實驗以及體內(nèi)移植實驗，發(fā)現(xiàn)當敲除小鼠MLL-AF9細胞中的受體結(jié)合蛋白1（RIP1）基因后，相對于WT MLL-AF9細胞，其克隆形成能力明顯減弱，移植后小鼠生存時間延長了3倍以上.在組織切片觀察中，WT MLL-AF9細胞移植小鼠出現(xiàn)明顯白血病發(fā)病特征，而RIP1-/-MLL-AF9細胞移植小鼠的切片顯示正常.當將RIP1中的激酶活性位點突變后，相對于WT MLL-AF9細胞，在移植實驗中小鼠生存時間明顯延長.對病發(fā)小鼠的脾臟細胞流式分析結(jié)果表明：激酶活性位點突變后致病能力明顯減弱，提示RIP1基因的缺失會導(dǎo)致MLL-AF9致病能力減弱.

關(guān)鍵詞： 受體結(jié)合蛋白1（RIP1）; MLL-AF9; 克隆形成; 生存時間; 激酶活性

中圖分類號： R 733.71 ?文獻標志碼： A ?文章編號： 1000-5137（2019）05-0495-08

Abstract： In this article，by using the clonality assay and transplantation experiments in vivo，we found that the MLL-AF9 cells knocked out receptor-interating protein 1（RIP1） gene showed more weaken clonality，comparing with WT MLL-AF9 cells，and the survival experiments show the survival time of RIP1-/-（MLL-AF9） mice is extended more 3 times than WT MLL-AF9 mice after transplantation.The morphology of leukemia is observed in WT MLL-AF9 cells transplanted mices tissue sections，while the sections of RIP1-/-MLL-AF9 cells are normal.When we mutate the kinase active sites in RIP1，the survival time of these mice is longer than the mice transplanted with WT MLL-AF9 cells.In the flow cytometry analysis of spleen cells of diseased mice，we found the mutations in the kinase active sites showed a significant decrease of pathogenicity.It is suggested that the deletion of the RIP1 gene leads to a decrease in the pathogenic ability of MLL-AF9 cells.

Key words： Receptor-Interacting Protein 1 （RIP1）; MLL-AF9; clonality; survival time; kinase activity

0 引 言

急性髓系白血?。ˋML）是一種侵襲性造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率與年齡相關(guān)，且老年患者占有較高的比例.在老年AML患者中，其病情不僅更加復(fù)雜，而且治療效果差[1].現(xiàn)階段針對AML的治療方案仍以聯(lián)合化療為主.該方案雖能使大部分患者病情達到完全緩解，但也極易出現(xiàn)愈后復(fù)發(fā)的情況，因此尋找一條更加有效的白血病治療途徑是當前血液病研究領(lǐng)域的一項重要任務(wù).AML治療的難點在于靜息下的白血病干細胞（LSCs）對于化療藥物具有耐藥性且能夠逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)察[2-3].同時在細胞數(shù)量極少的情況下，LSCs具有自我更新和重建白血病的能力[4]，因此治療的重點應(yīng)是有效清除患者體內(nèi)的LSCs.

BINDER等[5]通過對LSCs的研究發(fā)現(xiàn)：由腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導(dǎo)的程序性壞死在AML細胞中被激活但并不發(fā)生壞死.受體結(jié)合蛋白1（RIP1） 在細胞凋亡程序性壞死、細胞存活中具有重要的調(diào)控作用，是該通路中的關(guān)鍵因子[6-8].在肺癌研究中，RIP1基因的表達與正常細胞相比明顯增高，并且增高程度與癌癥的惡性程度正相關(guān)[9].研究結(jié)果也表明：RIP1能調(diào)節(jié)NF-κB信號傳導(dǎo)[10-11]，而NF-κB信號傳導(dǎo)在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用[12-15].在AML細胞中抑制NF-κB信號通路的激活能夠促進細胞的死亡[16].而抑制RIP1基因的表達在神經(jīng)損傷等疾病治療中已有過運用[17-18]，尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的副作用.

本文作者通過克隆形成能力實驗以及細胞體內(nèi)移植實驗探究了RIP1基因缺失或突變對MLL-AF9細胞致病能力的影響.結(jié)果顯示，當MLL-AF9細胞中RIP1基因缺失后與WT MLL-AF9細胞相比，白血病干細胞集落數(shù)明顯減少，移植后小鼠生存時間明顯延長，在脾臟等組織切片中出現(xiàn)白血病浸潤的情況更少.因此可以得出結(jié)論：RIP1基因缺失或突變會減弱MLL-AF9細胞致病能力.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞株及培養(yǎng)基：RIP1-/-MLL-AF9細胞、WT MLL-AF9細胞、Phoenix-Eco包裝細胞，以及K45A，K377R，RIP1質(zhì)粒由洛約拉大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供;血清使用澳大利亞Gibco公司的胎牛血清;Roswell Park Memorial Institute-1640（RMPI-1640）培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自于Hyclone公司;細胞因子SCF，IL-6，IL-3購自PeproTech公司;不同型號細胞培養(yǎng)皿購自Corning公司;8周齡清潔級C57雄性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司;脾臟組織切片委托蘇州西山中科實驗動物有限公司制備.

1.2 實驗試劑

臺盼藍染液購自Sigma公司;紅細胞（RBC）裂解液購自eBioscience公司;甲基纖維素培養(yǎng)基購自STEMCELL Technologies公司;4%（質(zhì)量分數(shù)）多聚甲醛溶液購自北京賽馳生物科技有限公司.

其他試劑、化學(xué)試劑均使用實驗室常用試劑.

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

細胞的凍存與復(fù)蘇遵循“慢凍速溶”的原則.細胞的完全培養(yǎng)基配方為：胎牛血清（FBS） 100 μL·mL-1，SCF 100 ng·mL-1，IL-6 50 ng·mL-1，IL-3 20 ng·mL-1，以RMPI-1640為體系中的溶劑.懸浮細胞培養(yǎng)體系體積為3 mL，每隔24 h傳代，控制傳代時細胞濃度為1.0×106～1.5×106 mL-1.

1.3.2 克隆形成能力實驗

將細胞接種于甲基纖維素培養(yǎng)基中，細胞濃度為1000 mL-1，每組細胞設(shè)置3個平行樣，在37 ℃，5%（體積分數(shù)）CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后，于顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)量大于等于50的集落數(shù)，并記錄.

1.3.3 體內(nèi)實驗

將8周齡C57小鼠半致死輻照后進行尾靜脈注射，每只小鼠注射2×104個白血病干細胞和2×105個支持細胞，支持細胞取自正常的8周齡C57小鼠.在輻照前2 d及輻照后2周內(nèi)給小鼠喂食含抗生素的飲用水，防止因輻照后免疫系統(tǒng)缺陷造成小鼠感染病菌死亡，對實驗結(jié)果造成影響.細胞移植后觀察小鼠生存狀態(tài)，記錄小鼠存活時間.

1.3.4 組織切片

待小鼠發(fā)病死亡后立即進行解剖，取出其肝臟、脾臟組織于4%（體積分數(shù)）多聚甲醛溶液中固定，將固定的組織委托蘇州中山生物有限公司制備組織切片.

1.3.5 逆病毒轉(zhuǎn)染細胞

鋪板：在直徑為6 cm培養(yǎng)皿中接種3×106個Phoenix-ECO細胞，加入4 mL含10% （體積分數(shù)）FBS的Dulbeccos Modified Eagle Medium （DMEM）培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 h后，將原培養(yǎng)液吸除，加入4 mL含13%（體積分數(shù)）FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件同上.

轉(zhuǎn)染：待細胞培養(yǎng)3 h后，于5 mL離心管中配置1 mL含500 μL 2×HEPES-buffered Saline（HBS），61 μL物質(zhì)的量濃度為2 mol·L-1的Ca2+溶液，21 μg質(zhì)粒，及無菌水的混合液，加入到培養(yǎng)體系中，并加入2 μL 物質(zhì)的量濃度為25 μmol·L-1的氯喹混合均勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).

換液：培養(yǎng)12 h 后吸去培養(yǎng)液，并用PBS漂洗一遍，加入2 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h 后換入新鮮的2 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后將細胞置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

收集病毒：待培養(yǎng)24 h 后收集培養(yǎng)上清于4 ℃ 保存，再加入相同的培養(yǎng)基繼續(xù)于 32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后再次收集上清，將2次上清集中，并用孔徑（直徑）為0.45 μm的針頭過濾器過濾.

轉(zhuǎn)染：在1 mL 病毒上清中加入2×106個RIP1-/-MLL-AF9細胞，再加入6 μg polybrene助染，在32 ℃下，2500 r·min-1離心4 h后收集細胞培養(yǎng).

純化：培養(yǎng)幾代后利用流式細胞分選儀分選出有綠色熒光蛋白（GFP+）信號的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，細胞陽性率在98%以上，即可用于實驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 體外克隆形成實驗

首先需要確認RIP1基因敲除后，在體外條件下，是否對白血病細胞的克隆形成能力有影響.通過克隆形成實驗得到的結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：敲除RIP1基因后，RIP1-/-MLL-AF9白血病干細胞的集落數(shù)量與WT MLL-AF9白血病干細胞集落數(shù)量相比明顯減少.

2.2 RIP1缺失細胞的小鼠體內(nèi)移植實驗生存曲線

對移植了WT MLL-AF9白血病細胞和RIP1-/-MLL-AF9白血病細胞的小鼠進行觀察并繪制生存曲線（圖2）.由圖2可知：WT MLL-AF9 組小鼠在移植3周后開始出現(xiàn)行動遲緩、精神萎靡的情況;在移植后29～35 d內(nèi)全部死亡.死后解剖小鼠，發(fā)現(xiàn)WT MLL-AF9組小鼠脾臟腫大，呈現(xiàn)出較為典型的白血病發(fā)病癥狀;而RIP1-/-MLL-AF9組全部小鼠生存時間達110 d以上，且移植后其生存狀態(tài)良好，處死發(fā)現(xiàn)脾臟大小正常，未發(fā)生白血病.根據(jù)以上結(jié)果可以得出結(jié)論：MLL-AF9細胞中RIP1的敲除對小鼠的生存有明顯的幫助.

2.3 RIP1缺失的小鼠脾臟組織切片

在體內(nèi)移植實驗的基礎(chǔ)之上，將死亡小鼠的脾臟用4%（質(zhì)量分數(shù)）多聚甲醛溶液浸泡固定，做組織切片，切片結(jié)果如圖3所示.由圖3可知：RIP1-/-MLL-AF9組小鼠脾臟的白髓紅髓結(jié)構(gòu)完整，未見到白血病病發(fā)特征;WT MLL-AF9組脾臟的紅髓白髓分解不清，見彌漫性白血病細胞.以上結(jié)果證實WT MLL-AF9組小鼠死于白血病，而RIP1-/-MLL-AF9組并沒有發(fā)生白血病.

2.4 逆病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

為了觀察突變RIP1對MLL-AF9造成的影響以及再次證實RIP1的作用，將RIP1的2種突變體質(zhì)粒K45A（激酶活性位點突變）、K377R（泛素化活性位點突變），以及RIP1質(zhì)粒通過逆病毒轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入RIP1-/-MLL-AF9細胞中.由于載體質(zhì)粒為Migr1，帶GFP+報告基因，在一段時間的培養(yǎng)后可通過流式分析判斷質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率.如圖4所示，K45A突變體質(zhì)粒和RIP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞后能夠穩(wěn)定表達，而K377R突變體質(zhì)粒在轉(zhuǎn)入細胞后，隨著一段時間的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)帶GFP+信號的細胞比例在逐漸下降，表示該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞后不能穩(wěn)定表達.

2.5 RIP1突變細胞的小鼠體內(nèi)移植實驗生存曲線

圖5為MLL-AF9白血病干細胞移植C57小鼠實驗生存曲線.由圖5可知：WT MLL-AF9組小鼠在移植3周后出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩等特征，在移植后35 d內(nèi)全部死亡.在小鼠瀕死時解剖小鼠，發(fā)現(xiàn)WT MLL-AF9組小鼠脾臟腫大，表現(xiàn)出較為典型的白血病病發(fā)特征.而RIP1-/-MLL-AF9組小鼠移植后生存狀態(tài)正常，且生存達3個月以上，處死時觀察脾臟，大小正常.值得注意的是，RIP1WTMLL-AF9組較正常的WT MLL-AF9組的發(fā)病時間有一定的延遲，可能是由于質(zhì)粒在細胞中的表達量低于RIP1基因本身在細胞中的表達量.將RIP1K45AMLL-AF9組的結(jié)果與RIP1WTMLL-AF9組的結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)RIP1K45AMLL-AF9組小鼠開始死亡的時間較晚，生存時間較久，說明RIP1激酶活性突變后對小鼠的生存有一定程度上的幫助.

2.6 RIP1突變細胞的小鼠脾臟肝臟組織切片

將死亡小鼠的肝臟和脾臟組織浸泡在4%（質(zhì)量分數(shù)）多聚甲醛溶液中，做組織切片，切片結(jié)果如圖6所示.由圖6可知：WT組、RIP1K45AMLL-AF9組以及RIP1WTMLL-AF9組的脾臟白髓紅髓分界不清，可見白血病細胞彌漫性浸潤;肝臟主要以中央靜脈及匯管區(qū)血管周圍為主，被大量白血病細胞浸潤，肝竇內(nèi)見散在白血病細胞;RIP1-/-MLL-AF9組的脾臟白髓紅髓結(jié)構(gòu)清晰完整;肝臟正常，肝細胞大小正常，肝索肝竇結(jié)構(gòu)清晰.以上結(jié)果證實，除RIP1-/-MLL-AF9組外，其他組小鼠均死于白血病.

2.7 細胞陽性比例

在對RIP1-/-MLL-AF9組脾臟細胞進行流式分析時發(fā)現(xiàn)了一個有意義的現(xiàn)象：RIP1K45AMLL-AF9組的小鼠死亡后脾臟中GFP+細胞的比例約為90%，而RIP1WTMLL-AF9組小鼠的脾臟中GFP+細胞的比例在35%左右，結(jié)果如圖7所示.根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，這兩者間差異顯著，結(jié)合圖6的生存曲線，表明RIP1K45AMLL-AF9白血病干細胞與RIP1WTMLL-AF9白血病干細胞相比，致病能力較弱，所以需要較多細胞浸潤到小鼠脾臟、肝臟中才會導(dǎo)致小鼠死亡.

3 結(jié) 論

本研究通過克隆形成能力實驗、體內(nèi)移植實驗、組織切片和流式細胞分析等實驗，探究了RIP1基因在MLL-AF9細胞中發(fā)揮的作用.體內(nèi)實驗結(jié)果表明：當RIP1-/-MLL-AF9細胞移植到小鼠體內(nèi)后，相對于移植了WT MLL-AF9細胞的小鼠，其生存時間延長了3倍以上.從最終小鼠脾臟、肝臟的形態(tài)及組織切片上觀察到：RIP1基因的缺失阻礙了MLL-AF9細胞浸潤到其他器官中.因此可以得出結(jié)論：當RIP1基因缺失后，MLL-AF9細胞的致病能力得到抑制.通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染得到了帶有GFP+報告基因的RIP1K45AMLL-AF9白血病干細胞、RIP1K377RMLL-AF9和RIP1WTMLL-AF9白血病干細胞，但轉(zhuǎn)染過程中發(fā)現(xiàn)RIP1K377R質(zhì)粒轉(zhuǎn)入RIP1-/- MLL-AF9細胞后不能穩(wěn)定表達，這提示特異性的抑制RIP1的泛素化作用可能會對MLL-AF9白血病干細胞的生長、增殖產(chǎn)生影響.體內(nèi)移植實驗顯示：RIP1K45AMLL-AF9組較之于RIP1WTMLL-AF9組發(fā)病晚、存活久.對于小鼠脾臟的GFP+細胞比例分析顯示：RIP1K45AMLL-AF9組小鼠死亡時脾臟細胞GFP+的比例較高.以上結(jié)果表明RIP1的激酶作用缺失會減弱MLL-AF9白血病干細胞的致病能力，提示在治療急性髓系白血病時，可以利用細胞信號通路的抑制劑特異性來抑制RIP1基因功能，進行輔助治療.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）