彭鐮心 *，張艷紅，魏麗娟，劉婉瑩，宋盼盼，趙鋼

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（成都 611130）；2. 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院（成都 610106）；3. 成都大學(xué)農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610106）

蕎麥（Buckwheat）屬蓼科，主要栽培種有甜蕎（Fagopyrum esculentum Moench）和苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn），為一年生栽培植物。甜蕎營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量達(dá)8.5%～18.9%[1-2]，8種必需氨基酸組成更加均衡合理[3-4]；同時(shí)，甜蕎中有酚類、黃酮類、糖醇類、蛋白質(zhì)、多肽等活性成分，具有降血壓、降低毛細(xì)血管脆性、改善微循環(huán)、提高人體免疫力等方面的藥理功效[5-7]，發(fā)芽后蕎麥中蘆丁等酚類成分含量顯著增加[8]。

酚類成分是廣泛存在于植物界的一類具有多種生理功能的活性物質(zhì)，是植物性食物發(fā)揮保健功能性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]，被廣泛運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、食品、制革和日化等相關(guān)領(lǐng)域。甜蕎作為小宗雜糧，發(fā)芽后其活性成分大大增加，為了深度挖掘甜蕎的發(fā)展?jié)摿?，?yīng)該對(duì)甜蕎芽中的酚類成分進(jìn)行相關(guān)分析。由于測(cè)定方法和對(duì)照品來(lái)源的限制，甜蕎芽中的酚類成分的定量大多采用紫外分光光度計(jì)比色法進(jìn)行酚類成分的定量[11]，還沒有建立超高效液相測(cè)定甜蕎芽中酚類成分的方法，不能對(duì)甜蕎芽中各個(gè)酚類成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量，在甜蕎芽的質(zhì)量控制上存在一定的限制。一測(cè)多評(píng)法通過(guò)計(jì)算待測(cè)成分間校正因子，可實(shí)現(xiàn)在只有一種對(duì)照品的情況下同時(shí)測(cè)定多種成分，已被廣泛應(yīng)用于中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中[12-13]。

試驗(yàn)以7種甜蕎芽為研究對(duì)象，選擇蘆丁作為參照，即只測(cè)定蘆丁這一個(gè)成分，通過(guò)確定它與葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素之間的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，通過(guò)外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法得到7種甜蕎芽中各酚類成分的含量，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法在甜蕎芽的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中的適用性，進(jìn)而建立甜蕎芽中酚類成分質(zhì)量控制的方法，為甜蕎芽中酚類成分的測(cè)定提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

寧蕎1號(hào)、品甜2號(hào)、紅花甜蕎、赤甜1號(hào)、定甜3號(hào)、豐甜1號(hào)、寧甜1號(hào)（四川省金堂蕎麥基地）；葒草素對(duì)照品（批號(hào)：waq-16041301）、異葒草素對(duì)照品（批號(hào)：wak-16080404）、牡荊素對(duì)照品（批號(hào)：130522）、異牡荊素對(duì)照品（批號(hào)：wak-16082004）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：wak-16031602）：純度均大于98%，四川維克奇生物科技有限公司；甲醇（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；冰乙酸（色譜純，成都市科龍化工試劑廠）；水（重蒸餾水）；其余試劑（均為分析純）。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀（QSM四元泵、SM-FTN進(jìn)樣器、CH-A柱溫箱、PDA檢測(cè)器：沃特世上?？萍加邢薰荆籉D-2真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有點(diǎn)公司）；CP 224 C十萬(wàn)分之一電子分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；KQ 5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H 2050 R高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甜蕎芽的制備

挑選顆粒飽滿、大小均一的甜蕎粒，清洗、除雜，在純凈水中浸泡24 h（料液比約為1︰3 g/mL），將浸泡好的甜蕎粒置于鋪有營(yíng)養(yǎng)土的育苗盤中，置于溫度為25 ℃、濕度為80%的人工氣候箱中黑暗培養(yǎng)7 d，再放置于相同溫度、濕度，每天光照12 h的條件下培養(yǎng)2 d，定時(shí)噴水，第10天采收；采用FD-2真空冷凍干燥機(jī)對(duì)甜蕎芽進(jìn)行干燥，粉碎，過(guò)80目篩，冷藏備用[14]。

1.2.2 酚類成分對(duì)照品的制備

精密稱取0.007 70 g葒草素對(duì)照品、0.001 32 g異葒草素對(duì)照品、0.008 98 g牡荊素對(duì)照品、0.008 10 g異牡荊素對(duì)照品、0.007 20 g蘆丁對(duì)照品，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加無(wú)水甲醇溶解并定容至10 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，其質(zhì)量濃度分別為葒草素770 μg/mL、異葒草素132 μg/mL、牡荊素898 μg/mL、異牡荊素810 μg/mL、蘆丁720 μg/mL。分別取適量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液置于10 mL棕色容量瓶，加無(wú)水甲醇定容至10 mL，制成葒草素38.5 μg/mL、異葒草素26.4 μg/mL、牡荊素44.9 μg/mL、異牡荊素40.5 μg/mL、蘆丁36 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃保存，備用。

1.2.3 甜蕎芽粉中酚類成分的提取

精密稱取1.000 g甜蕎芽粉樣品于10 mL離心管中，加10 mL 95%甲醇水溶液，搖勻并稱重，于60 ℃超聲處理30 min，取出冷卻至室溫，用95%甲醇水溶液補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，于12 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取過(guò)濾液，待測(cè)[15]。

1.2.4 甜蕎芽中酚類成分測(cè)定的色譜條件

色譜柱ACQUITYUPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.2%冰乙酸水溶液（B）；梯度洗脫為0～3 min，10%～26% A；3～5 min，26%～29% A；5～9.5 min，29%～38% A；9.5～13 min，38%～44% A；13～15 min，44% A；15～17 min，44%～ 10% A；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為35 ℃；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL[15]。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系考察和檢出限

精密吸取適量“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，置于10 mL容量瓶中，加95%甲醇水溶液定容至刻度，搖勻，配成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每個(gè)濃度分別進(jìn)樣3次，取平均值，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），繪制葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各成分的回歸方程及線性范圍。精密吸取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，以信噪比（S/N）為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為其檢出限。

1.2.5.2 待測(cè)成分的?s/x的計(jì)算

以蘆丁（s）為內(nèi)參物，根據(jù)公式?s/x=?s/?x=AxCs/(AsCx)計(jì)算蘆丁與葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素之間的?s/x。式中：Cs、Cx分別代表內(nèi)參物與待測(cè)物成分的質(zhì)量濃度，As、Ax分別代表內(nèi)參物與待測(cè)成分的儀器響應(yīng)值。再通過(guò)?s/x方法計(jì)算甜蕎芽中葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素4種成分的質(zhì)量濃度。

1.2.5.3 儀器精密度考察

取適量葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對(duì)照品，按“1.2.2”項(xiàng)下的制備方法制備混合標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值，以峰面積積分值分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.5.4 方法精密度

取6份甜蕎芽粉末樣品（過(guò)80目篩），按“1.2.3”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制備甜蕎芽提取液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值，以峰面積分別計(jì)算RSD值。

1.2.5.5 穩(wěn)定性考察

取甜蕎芽粉末樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制備甜蕎芽提取液，精密吸取同一樣品溶液，分別在0，4，6，8，12和24 h進(jìn)樣1 μL，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的峰面積積分值，按峰面積積分值分別計(jì)算RSD值。

1.2.5.6 加樣回收率考察

取已知成分含量寧蕎1號(hào)甜蕎芽樣品粉末，精密稱取約1.000 g，共6份，分別加入1 mL葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁對(duì)照品，質(zhì)量濃度分別為5.20，2.70，1.93，14.67和2.75 mg/mL，按“1.2.3”項(xiàng)下供試品的制備方法制備提取液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的平均加樣回收率和RSD值。

1.2.6 樣品測(cè)定及一測(cè)多評(píng)法的驗(yàn)證

取各個(gè)品種的甜蕎芽粉末各約1.00 g，精密稱定，按“1.2.3”方法制備甜蕎芽提取液，采用外標(biāo)法按“1.2.4”方法測(cè)定7種不同品種甜蕎芽中5種成分含量。再按照建立的一測(cè)多評(píng)法對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行色譜峰的定位，以蘆丁為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其余待測(cè)成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類成分對(duì)照品和樣品色譜圖

預(yù)試驗(yàn)對(duì)柱溫、波長(zhǎng)、流速、流動(dòng)相等條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，最佳色譜條件為：ACQUITYUPLC?BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱；流動(dòng)相，甲醇（A）-0.2%冰乙酸水溶液（B）；檢測(cè)波長(zhǎng)，254 nm；柱溫，35 ℃；流速，0.2 mL/min；進(jìn)樣量，1 μL。色譜條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，甜蕎芽中葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁5種酚類成分分離良好，出峰時(shí)間分別為6.535，6.772，7.438，8.234和8.660 min。

圖1 酚類成分混合對(duì)照品溶液色譜圖（A）和樣品色譜圖（B）

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

通過(guò)線性回歸分析，得到各成分的回歸方程式和線性范圍，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁分別在77.0～770.0，13.2～132.0，89.8～898.0，81.0～810.0和72.0～720.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 甜蕎芽中5種酚類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、檢出限與回收率考察結(jié)果

葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、相對(duì)保留時(shí)間、加樣回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，由此可知超高效液相儀的精密度良好，甜蕎芽酚類成分重復(fù)性良好，酚類成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定；5種酚類成分的回收率在95%～105%之間，說(shuō)明甜蕎芽酚類成分的提取方法準(zhǔn)確可靠；當(dāng)稱樣量為1.000 g，提取體積為10 mL時(shí)，5種酚類成分檢出限范圍為1.00～8.94 mg/kg，結(jié)果見表2。

表2 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、檢出限與回收率考察結(jié)果

2.2.3 待測(cè)成分的?s/x的計(jì)算

由表3可知，各相對(duì)校正因子的RSD值分別為2.30%，2.61%，1.50%和3.98%，均小于5%。經(jīng)分析和綜合比較影響相對(duì)校正因子的因素，取各質(zhì)量濃度下獲得的相對(duì)較正因子（?s/x）的平均值，最終確定葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素與蘆丁的?s/x分別為0.66，2.51，1.30和0.30。

表3 4種酚類成分與蘆丁的相對(duì)校正因子

2.3 一測(cè)多評(píng)法的驗(yàn)證

分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法對(duì)7種甜蕎芽進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表4。為了確認(rèn)一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性，用外標(biāo)法進(jìn)行比較，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素的相對(duì)誤差范圍分別為1.65%～1.82%，3.52%～ 3.59%，0.87%～1.13%和0.68%～0.72%。ESM實(shí)際測(cè)定含量與試驗(yàn)所建立的QAMS計(jì)算所得含量，采用DPS軟件對(duì)兩種方法測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法所得量值無(wú)顯著性差異（p＞0.05），說(shuō)明試驗(yàn)所建立的一測(cè)多評(píng)法具有較好的準(zhǔn)確性和可行性，在甜蕎芽的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用是可行的。

同時(shí)由圖2可知，品甜2號(hào)和紅花甜蕎品種之間的牡荊素和異牡荊素沒有顯著性差異外，其余品種之間各成分均有顯著差異。7種甜蕎芽中5種酚類成分中含量最高的品種都是品甜2號(hào)，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量分別為7.55×103，3.70× 103，2.83×103，21.20×103和5.41×103mg/kg；含量最低的是定甜3號(hào)，葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量分別為2.89×103，1.40×103，1.00×103，7.23×103和1.56×103mg/kg。不同品種之間總酚（5種酚類成分的總和）也有顯著性差異（圖3），含量最高的是品甜2號(hào)，為4.08×104mg/kg；含量最低的是定甜3號(hào)，為1.41×104mg/kg。

圖2 不同品種甜蕎芽間酚類的比較

圖3 不同甜蕎芽品種間總酚的比較

表4 一測(cè)多評(píng)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定結(jié)果 ×103 mg/kg

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)建立了甜蕎芽5種酚類成分的一測(cè)多評(píng)檢測(cè)方法，5種酚類成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、相對(duì)保留時(shí)間以及加樣回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%；葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁的回收率分別為99.64%，98.68%，101.83%，98.61%和103.75%，在95%～105%范圍之內(nèi)，表明甜蕎芽中5種酚類成分分離良好、各組分色譜峰的峰形對(duì)稱、儀器精密度良好，方法學(xué)考察表明所建立的甜蕎芽5種酚類成分的超高效液相色譜測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠，可供甜蕎芽中5種酚類成分的快速準(zhǔn)確定量。并且利用DPS 14.50軟件對(duì)7種甜蕎芽中5種酚類成分的一測(cè)多評(píng)法計(jì)算值和外標(biāo)法測(cè)定值進(jìn)行差異性分析。結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)法計(jì)算值與外標(biāo)法測(cè)定值之間沒有顯著性差異（p＞0.05）。通過(guò)分析5種成分之間的差異，異牡荊素是所有甜蕎芽中含量最高的成分，顯著高于其他4種酚類成分（p＜0.05），質(zhì)量濃度范圍為7.16×103～2.10×104mg/kg；牡荊素是所有甜蕎芽中含量最低的酚類成分，顯著低于其他4種酚類成分（p＜ 0.05），質(zhì)量濃度范圍為9.80×102～2.78×103mg/kg；葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁總含量最高的品種是品甜2號(hào)，為4.08×104mg/kg，含量最低的品種是定甜3號(hào)，為1.41×104mg/kg；由此可見，不同的品種之間各酚類成分的含量具有一定的差異。