唐 森，梁冰娜，覃逸明， 吳國(guó)勇，張 鵬

(1.廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西 來(lái)賓 546119;2.廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 來(lái)賓 546119;3.廣西科技師范學(xué)院 科研管理處，廣西 來(lái)賓 546119)

白芨Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.]是蘭科白芨屬的一種多年生草本植物，又名為白根、羊角七、冰球子、白烏兒頭、地螺絲、白雞兒、白雞娃、連及草等。地下有粗厚的根狀莖，如雞頭狀，富粘性，含白芨膠質(zhì)，即白芨甘露聚糖，可供藥用，有收斂止血、生肌止痛之效，也可供作糊料，花美麗，也可供觀賞。產(chǎn)地主要在我國(guó)廣西、貴州、云南、四川、陜西南部等，白芨是蘭科白芨屬的藥用植物，對(duì)細(xì)菌和其他病原菌微生物均有抑菌和殺菌作用[1-3]。白芨中的有效成分主要為中性雜多糖,白芨多糖是由β-( 1→4)-甘露糖、β-( 1→4)-葡萄糖和α-( 1→6)葡萄糖殘基組成的中性雜多糖[4-5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白芨多糖具有抗腫瘤和增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用，可作為功能性食品成分及膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，此外白芨中其他主要化學(xué)成分中的物質(zhì)，具有抗炎癥、延緩衰老及促進(jìn)創(chuàng)傷愈合作用等功效[6]。由此可見(jiàn)，白芨多糖蘊(yùn)含著豐富的藥理活性，多糖提取是國(guó)內(nèi)外學(xué)者感興趣的研究熱點(diǎn)之一，本試驗(yàn)采用水作為提取試劑，通過(guò)水浴提取法提取白芨水溶性多糖，對(duì)液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)白芨多糖提取率的影響展開(kāi)研究，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化，確定最佳提取工藝，為白芨多糖進(jìn)一步在各個(gè)領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白芨購(gòu)于廣西來(lái)賓市桂中大藥房，經(jīng)廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張鵬博士鑒定為白芨，試驗(yàn)所用葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、正丁醇、三氯甲烷均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

FW135 中草藥粉碎機(jī)( 天津市泰斯特儀器有限公司)；FA2004B 型電子分析天平( 上海越平科學(xué)儀器有限公司)；HH-S4 型恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-D(III)循環(huán)水多用真空泵(鞏義市科瑞儀器有限責(zé)任公司)；C-20玻璃儀器氣流烘干器(上海貝侖儀器設(shè)備有限公司)；H3-20KR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司)；UV-9600紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京北分瑞利分析儀器(集團(tuán))公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白芨原材料前處理

將白芨片平鋪于烘盤內(nèi)，置于70℃的熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，利用中草藥粉碎機(jī)將烘干后的白芨片破碎，并過(guò)40目篩網(wǎng)，裝入密封袋備用。

1.3.2 白芨水溶性多糖的提取

以蒸餾水作為提取溶劑，準(zhǔn)確稱取白芨粉末1.0 g置于三角燒瓶中，水浴加熱提取，按照試驗(yàn)所需的液料比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行提取，水浴提取后，放入冷水中迅速冷卻至室溫，過(guò)濾，收集提取液，定容，得到供試品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照張翰韜等[7]的方法并稍作修改，用電子分析天平準(zhǔn)確稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g，加入蒸餾水進(jìn)行溶解，然后轉(zhuǎn)移至規(guī)格100 mL容量瓶中，定容后充分搖勻，即可得到100 μg·mL-1葡萄糖對(duì)照品溶液，放置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

用移液槍移取葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL，分別置于具塞試管中，并分別加入蒸餾水2.0，1.7，1.6，1.5，1.4，1.3，1.2，1.1 mL，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液，搖晃均勻后迅速加入5.0 mL的濃硫酸(與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應(yīng)液充分混合)，搖勻后在室溫下放置5 min，然后將具塞試管放置于40℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，取出迅速用冷水冷卻至室溫。另以蒸餾水2.0 mL，同以上操作作空白對(duì)照，在最大吸收波長(zhǎng)(490 nm)處測(cè)定吸光度值。然后以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg·mL-1)，吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=0.0832x-0.1704，R2=0.9994，表明線性關(guān)系良好。

1.3.4 白芨多糖提取的測(cè)定

參照張翰韜等[7]的方法并稍作修改，移液槍吸取上述所得供試品溶液2 mL于100 mL的容量瓶中，加入適量蒸餾水進(jìn)行定容，搖晃均勻后精密吸取20 mL稀釋液于離心管中，加入4 mL Savage試劑(V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1)，使供試品稀釋液與Savage試劑體積比為5∶1，搖勻，放入離心機(jī)中在2000 r·min-1條件下離心20 min，離心后取2 mL上清液轉(zhuǎn)移至干凈的具塞試管中，按1.3.4中方法測(cè)定吸光度，將吸光度值帶入線性回歸方程，計(jì)算出粗多糖溶液的濃度ρ，再按式計(jì)算出樣品中多糖提取率：

式中：ρ為粗提物樣液葡萄糖質(zhì)量濃度(μg·mL-1)；D為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量(μg)；V為最初樣品定容體積即液料比體積，mL。

1.3.5 單因素考察試驗(yàn)

本次實(shí)驗(yàn)選取蒸餾水作為提取溶劑，采用水浴加熱法提取白芨水溶性多糖，考察提取溫度、提取時(shí)間、液料比三個(gè)因素對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響。

1.3.5.1 提取溫度對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響

稱取經(jīng)前處理后的白芨1.0 g于三角燒瓶中，固定液料比為100∶1 mL·g-1，提取時(shí)間為4 h，分別設(shè)定提取溫度為50，60，70，80，90℃，經(jīng)水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷卻至室溫，過(guò)濾，按“1.3.4”中的方法測(cè)定白芨水溶性多糖提取率，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算白芨水溶性多糖提取率，確定最佳提取溫度。

1.3.5.2 提取時(shí)間對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響

稱取經(jīng)前處理后的白芨1.0 g于三角燒瓶中，固定液料比為100∶1 mL·g-1，提取溫度為80℃，分別設(shè)定提取時(shí)間為3，3.5，4，4.5，5 h，經(jīng)水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷卻至室溫，過(guò)濾，按“1.3.4”中的方法測(cè)定白芨水溶性多糖提取率，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算白芨水溶性多糖提取率，確定最佳提取時(shí)間。

1.3.5.3 液料比對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響

稱取經(jīng)前處理后的白芨1.0 g于三角燒瓶中，分別按液料比為70∶1，80∶1，90∶1，100∶1，110∶1 mL·g-1加入蒸餾水，用封口膜封口(防止在水浴加熱時(shí)，水分揮發(fā)，影響試驗(yàn)值)，置于80 ℃的水浴鍋中水浴4h，經(jīng)水浴提取后，迅速取出放置冷水槽中快速冷卻至室溫，過(guò)濾，按“1.3.4”中的方法測(cè)定白芨水溶性多糖提取率，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算白芨水溶性多糖提取率，確定最佳液料比。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取(A)提取溫度、(B)提取時(shí)間、(C)液料比三個(gè)影響因素為自變量，白芨水溶性多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[8-9]進(jìn)行3因素3水平的二次多項(xiàng)回歸組合響應(yīng)面試驗(yàn)，確定提取白芨水溶性多糖的最佳工藝條件，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼

1.3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選取響應(yīng)面試驗(yàn)分析得出的最佳工藝參數(shù)作為提取條件，3次重復(fù)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值SD表示，計(jì)算多糖提取率，以確定白芨水溶性多糖的最優(yōu)提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度單因素對(duì)白芨多糖提取率的影響

如圖1所示，隨著提取溫度的升高，白芨多糖提取量會(huì)逐漸升高，原因是溫度的升高加速分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度，有利于多糖的溶解，當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，白芨多糖提取率達(dá)到最高峰值，4.23%。當(dāng)提取溫度低于80℃時(shí)，多糖提取量隨提取溫度的升高增加緩慢，提取溫度達(dá)到80℃，多糖提取量會(huì)顯著增加，提取溫度高于80℃后，白芨多糖的提取率隨提取溫度上升而下降。說(shuō)明提取溫度過(guò)高，影響白芨多糖生理活性，繼續(xù)升高溫度只會(huì)引起部分多糖降解，繼而影響白芨多糖的提取率。因而確定本試驗(yàn)采用的水提法提取白芨多糖最佳提取溫度為80℃。

圖1 提取溫度對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

2.1.2 提取時(shí)間單因素對(duì)白芨多糖提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響如圖2所示，當(dāng)提取時(shí)間由3 h至4 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，白芨水溶性多糖提取率明顯增加，原因是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，白芨多糖能在水中得到充分溶解，提取量不斷上升。提取時(shí)間在4 h時(shí)，白芨多糖的提取率達(dá)到最高值，4.23%。當(dāng)提取時(shí)間長(zhǎng)于4 h后，白芨多糖提取量反而下降。綜合整體能耗及經(jīng)濟(jì)因素考慮，確定本試驗(yàn)的最佳提取時(shí)間為4 h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

2.1.3 液料比單因素對(duì)白芨多糖提取率的影響

圖3 液料比對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of water-soluble polysaccharides from Scutellaria baicalensis

液料比對(duì)白芨水溶性多糖提取率的影響如圖3所示，液料比在70∶1～100∶1 (mL·g-1)區(qū)間時(shí)，隨著提取溶劑體積的增大，白芨水溶性多糖提取率隨液料比的增大而急劇上升，液料比為100∶1 (mL·g-1)白芨多糖提取率達(dá)到峰值，4.23%。當(dāng)繼續(xù)增大液料比時(shí)，白芨多糖提取率隨液料比的增大而呈緩慢下降趨勢(shì)。因此確定本試驗(yàn)采用的水提法提取白芨多糖的最佳液料比為100∶1 (mL·g-1)。

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案結(jié)果及回歸方程的建立

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)和液料比(C)3個(gè)因素，以白芨水溶性多糖提取率(Y)為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，中心點(diǎn)設(shè)計(jì)5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 BOX-BEHNKEN試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用Design expert8.0.6.1軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，并因此得出白芨水溶性多糖提取率(Y)對(duì)提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)和液料比(C)的二元多項(xiàng)回歸方程：Y=4.26+0.0075A+0.084B+0.049C-0.058AB-0.078AC-0.065BC-0.14A2-0.16B2-0.06C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.9290，說(shuō)明該二次回歸方程擬合度較好，結(jié)果可靠，回歸方程方差分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

注：R2=0.9689，R2ADJ=0.9290，注:**差異極顯著(P<0.01);*差異顯著(P<0.05)

由表3方差分析可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?P=0.0002<0.01)，表明該模型回歸有極顯著差異；失擬值P=0.1149>0.05，表明差異不顯著及建立模型數(shù)據(jù)成立。R2=0.9689，表明響應(yīng)值多糖提取率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有很好的擬合度，可以用來(lái)優(yōu)化和預(yù)測(cè)白芨多糖最佳提取工藝條件。由二次回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，二次項(xiàng)的B2(F=66.68)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極其顯著性影響。一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2及交互項(xiàng)的AC有較顯著影響，剩余有顯著影響，綜合以上因素分析，表明考察因素對(duì)白芨多糖的提取率存在交互綜合影響作用。比較F值大小可反映出各因素對(duì)指標(biāo)的影響規(guī)律，由表3可知，一次項(xiàng)影響白芨多糖提取率的主次因素為：提取時(shí)間>液料比>提取溫度；二次項(xiàng)影響白芨多糖提取率的主次因素為：提取時(shí)間>提取溫度>液料比；交互項(xiàng)相互作用的主次順序?yàn)椋篈C>BC>AB。

2.2.2 等高線圖和3D響應(yīng)面圖分析

為直觀地考查各因素之間交互作用顯著與否，以進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)工藝，運(yùn)用 Design-Expert8.0.6 軟件對(duì)白芨多糖提取率響應(yīng)值分析作圖，得到由響應(yīng)值A(chǔ)、B、C 因素所構(gòu)成的三維空間圖及其三維空間在二維平面上的等高線圖。分析結(jié)果見(jiàn)圖4-圖6。由相關(guān)因素的3D響應(yīng)面圖及等高線圖結(jié)合可看出，提取時(shí)間對(duì)白芨多糖提取工藝的影響極大，在適宜提取時(shí)間下提取率較高，而當(dāng)提取時(shí)間過(guò)高時(shí)多糖提取率下降明顯。AC之間的交互作用最顯著，BC次之，AB之間交互作用最不顯著。

從圖4可知，提取時(shí)間與提取溫度的等高線近似圓形，表明提取時(shí)間與提取溫度的交互作用對(duì)白芨多糖提取率的影響不顯著。當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí)，白芨多糖提取率隨溫度的上升呈先增加后降低趨勢(shì)；提取溫度不變，隨時(shí)間的延長(zhǎng)白芨多糖提取率先升高后降低。

圖4 多糖提取率隨時(shí)間和溫度變化的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Time and Temperature

從圖5可直觀看出，當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí)，隨液料比的增加和提取溫度的上升，白芨多糖提取率先增大后減小。從3D響應(yīng)面圖及等高線圖結(jié)合可看出，等高線圖近似為橢圓可以說(shuō)明提取溫度和液料比間的交互作用對(duì)多糖提取率有影響，且提取溫度變化的曲面比液料比變化的曲面陡，說(shuō)明提取溫度對(duì)響應(yīng)值的影響大于液料比。

圖5 多糖提取率隨溫度和液料比變化的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Temperature and Solid-liquid Ratio

圖6中的三維圖形和等高線圖說(shuō)明了當(dāng)提取溫度不變時(shí)，多糖提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)和液料比增大呈先增加后降低趨勢(shì)。等高線圖近似為橢圓可以說(shuō)明提取時(shí)間和液料比間的交互作用對(duì)多糖提取率有影響，圖6的響應(yīng)面曲面最陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)提取時(shí)間和液料比兩操作條件的改變?cè)矫舾?，提取時(shí)間因素的交互作用對(duì)白芨多糖提取率的干擾性較強(qiáng)。

圖6 多糖提取率隨時(shí)間和液料比變化的響應(yīng)面與等高線Fig.6 Response Surface and Contour of Polysaccharide Extraction Rate with Time and Liquid-to-Material Ratio

2.3 最佳條件的預(yù)測(cè)以及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)回歸線性模型計(jì)算得最佳的實(shí)驗(yàn)提取條件是：提取溫度78.78℃，提取時(shí)間4.10 h，液料比103.77∶1 mL·g-1。結(jié)合實(shí)際，修正提取條件為提取溫度79℃，提取時(shí)間4.10 h，液料比104∶1 mL·g-1進(jìn)行試驗(yàn)，并且進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，白芨多糖的提取率是(4.27±0.05)%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以水做提取劑，采用水提法提取白芨多糖，使用苯酚-硫酸比色法測(cè)定白芨水溶性多糖，考查不同液料比、提取溫度、提取時(shí)間三因素對(duì)白芨多糖提取率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，得出最佳提取工藝條件。最佳的單因素條件為提取溫度80℃，提取時(shí)間4.00 h，液料比100∶1 mL·g-1。通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗(yàn)，用Box-Behnken軟件進(jìn)行分析，得出二次多項(xiàng)回歸方程：Y=4.26+0.0075A+0.084B+0.049C-0.058AB-0.078AC-0.065BC-0.14A2-0.16B2-0.06C2。最后得出最佳的提取工藝條件是提取溫度79 ℃，提取時(shí)間4.10 h，液料比104∶1 mL·g-1，白芨多糖的提取率是(4.27±0.05)%。