楊 睿 王婷婷 王孝友 鄭 華 盧皓中 付利芝*

1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶榮昌402460；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶榮昌402460

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）屬于腸桿菌科變形桿菌屬，是一種人獸共患的病原體，在自然界中廣泛存在。它不但能導(dǎo)致人的尿路感染，也能導(dǎo)致仔豬嘔吐與腹瀉，引起豬的敗血癥并產(chǎn)生不耐熱腸毒素反應(yīng)而導(dǎo)致病豬死亡。近年來，仔豬腹瀉病大面積流行，奇異變形桿菌作為一種能引起腹瀉的病原菌，沒有引起研究人員足夠的重視。在此項研究中，研究人員從122 份腹瀉仔豬的糞便樣本中分離了奇異變形桿菌，并對其毒力進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基購自杭州天和微生物公司；Genomic DNA Isolation Kit、Gel DNA Extraction Kit 盒購自O(shè)MEGA 公司；PCRMix、2000 MD 購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 樣品采集

2018年5月至2019年6月，在重慶地區(qū)的規(guī)模化豬場采集腹瀉仔豬的肛拭子，24 h 內(nèi)送實驗室進行細(xì)菌分離。

1.3 奇異變形桿菌的分離鑒定

將拭子用2 mL 無菌生理鹽水反復(fù)沖洗，吸取100 μL 接種到LB 平板培養(yǎng)基上，收集中心黑色邊緣為白色的光滑菌落，將其接種到TSA 培養(yǎng)基中，呈波浪型生長。采用煮沸法提取基因組，采用奇異變形桿菌特異性引物進行PCR擴增（PM-F：5'-ATCACAGTCACCACTAATCT-3'，PM-R：5'-TCTGACATCCAACAGTAATTG-3'，片段大小為539 bp），PCR產(chǎn)物送測序公司進行測序鑒定。

1.4 攻毒試驗

將鑒定為奇異變形桿菌的菌株在LB 液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)至對數(shù)期，采用NRO 到濃度為1×109CFU/mL 時停止培養(yǎng)，將每株菌取0.1 mL 對健康的昆明種小鼠（清潔級，體重20～25 g）進行腹腔注射，空白對照組同時注射0.1 mL 生理鹽水，觀察攻毒情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 奇異變形桿菌的分離鑒定結(jié)果

從重慶地區(qū)的規(guī)模化豬場中采集腹瀉仔豬的糞便樣本122 份，通過分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)可疑菌株32株（圖1）。通過特異性PCR對分離菌進行基因組擴增，有22 株菌出現(xiàn)了清晰的目標(biāo)條帶（圖2），將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行測序，通過在GenBank 上進行Blast 比對確認(rèn)為奇異變形桿菌。發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)奇異變形桿菌在腹瀉仔豬中的分離率為18.03%（22/122）。

2.2 攻毒試驗結(jié)果

對奇異變形桿菌進行攻毒試驗，在24 h 內(nèi)發(fā)現(xiàn)有15 株分離菌攻毒小鼠后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。攻毒后的小鼠出現(xiàn)肝臟、腎臟、脾臟明顯腫大、淤血現(xiàn)象；其中腸黏膜出血嚴(yán)重，剪開小腸可見內(nèi)部充滿了大量的黃色透明的粘液樣內(nèi)容物，表明奇異變形桿菌對腸道有較強的侵襲力（圖3）。

圖1 奇異變形桿菌的分離純化與鏡檢圖片

圖2 奇異變形桿菌特異性PCR電泳圖片

圖3 PM對小鼠攻毒24 h的解剖圖片

3 討論

奇異變形桿菌是目前我國公布的引起食物中毒的四大細(xì)菌性病原菌之一，可引起人和動物的泌尿系統(tǒng)感染和急性腹瀉。但目前對奇異變形桿菌致腹瀉的機制尚不清楚，常規(guī)檢測方法亦無法區(qū)分致腹瀉菌株和腸道正常攜帶菌株。當(dāng)前對奇異變形桿菌的研究主要集中在人醫(yī)上，對動物感染奇異變形桿菌的研究非常有限，僅在2013和2014年分別由任梅滲等和趙振鵬等報道了由奇異變形桿菌引起的仔豬腹瀉病例。在此項研究中我們收集了122 份腹瀉仔豬的糞便樣本，通過分離純化和分子生物學(xué)鑒定，確認(rèn)分離到奇異變形桿菌22 株，發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)奇異變形桿菌在腹瀉仔豬中的分離率為18.03%（22/122）。通過小鼠的攻毒試驗，其中有15 株能致小鼠死亡，攻毒后的小鼠腸道黏膜嚴(yán)重出血并伴有粘液樣內(nèi)容物，表明分離的奇異變形桿菌對腸道有較強的侵襲力。這些研究表明，奇異變形桿菌在仔豬腹瀉中可能扮演著重要的角色，需要引起獸醫(yī)工作者的重視。