張玉昆,安娜,劉衛(wèi)曉,宛煜嵩,金蕪軍,李亮*,張曉

1.長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)春 130022;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,北京 100081

脫氧核糖核酸(DNA)是已知的主要且最有研究意義的生物有機(jī)化合物，具有生物相容性和生物可降解性[1-2]，因此，DNA雜交反應(yīng)在分子檢測(cè)領(lǐng)域具有很重要的研究?jī)r(jià)值。了解非生物表面與功能性生物分子(如蛋白質(zhì)、DNA、適體等)之間存在的相互作用，在開(kāi)發(fā)用于生物傳感器和分子傳遞等的功能性生物界面方面起著至關(guān)重要的作用。例如，生物傳感器的發(fā)展需要各個(gè)生物分子識(shí)別元件的適當(dāng)分配、定向和改變構(gòu)象，以實(shí)現(xiàn)最佳活性、結(jié)合親和力和長(zhǎng)期穩(wěn)定性[3-6]。然而，由于待結(jié)合分子的復(fù)雜性和異質(zhì)性，研究界面是具有挑戰(zhàn)的。固體基質(zhì)上的固定/定位方法和較弱的親和力導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的不穩(wěn)定性[7-8]。

在過(guò)去的幾十年中，隨著納米材料的研發(fā)和聯(lián)用技術(shù)的飛速發(fā)展，研究界面性質(zhì)的先進(jìn)光譜電化學(xué)方法越來(lái)越受到關(guān)注。納米技術(shù)與納米材料科學(xué)的新成就，使不同大小(1～100nm)、形狀與組成(成分)的眾多納米材料介入生物傳感領(lǐng)域。納米粒子的小體積突破了結(jié)構(gòu)微型化的限制，導(dǎo)致了更低的檢測(cè)限，甚至可達(dá)到zmol(1 zmol=10-21mol)的水平。而且，生物功能化納米粒子可以產(chǎn)生催化性能、傳導(dǎo)性能與生物相容性能的協(xié)同作用，并加快信號(hào)傳導(dǎo)。更為重要的是，納米材料與環(huán)境直接接觸，可以直接作為化學(xué)與生物傳感器，實(shí)現(xiàn)生物分子的單分子檢測(cè)，從而使其廣泛應(yīng)用于生物體系。納米生物傳感的進(jìn)一步發(fā)展也為多種生物技術(shù)的聯(lián)用提供了有用工具。

光譜電化學(xué)可以通過(guò)電化學(xué)(electrochemical，EC)和光學(xué)技術(shù)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)原位界面表征。單獨(dú)的電化學(xué)方法通常不適合識(shí)別界面上發(fā)生的結(jié)合事件和構(gòu)象變化，因此需要額外的光學(xué)技術(shù)，例如表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)。SPR作為無(wú)標(biāo)記技術(shù)，便于研究界面上的相互作用[9-13]。然而，它對(duì)低濃度、小分子的檢測(cè)和非特異性結(jié)合的識(shí)別存在限制[14-17]。另外，由于衰減長(zhǎng)度的限制，SPR僅對(duì)距離金表面幾百納米距離內(nèi)的折射率變化具有檢測(cè)效應(yīng)。EC的設(shè)備簡(jiǎn)單，試驗(yàn)成本低。然而，對(duì)于許多生物分子，在電極上沒(méi)有發(fā)生直接的電子轉(zhuǎn)移，因此需要通過(guò)標(biāo)記分子的間接電子轉(zhuǎn)移，這增加了檢測(cè)的復(fù)雜性和費(fèi)用。同時(shí)，與法拉第電流一起產(chǎn)生的電容電流也會(huì)導(dǎo)致信號(hào)干擾。此外，EC難以鑒定中間體或產(chǎn)物的未知物質(zhì)。而SPR與電化學(xué)的耦合通常有利于它們相互彌補(bǔ)這些缺陷。因此，以SPR為主的EC-SPR聯(lián)用引起了極大的關(guān)注。本文綜述了近年來(lái)SPR和EC聯(lián)用的DNA傳感器應(yīng)用研究進(jìn)展，包括技術(shù)原理、聯(lián)用方法(CV-SPR、EIS-SPR、CV/EIS-SPR)與未來(lái)展望，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 電化學(xué)/表面等離子體共振(EC-SPR)技術(shù)基本原理

1.1 SPR基本原理

SPR光譜法是一種光學(xué)技術(shù)，可監(jiān)測(cè)固體表面上的折射變化，并與其他小分子或生物分子一起進(jìn)行修飾。折射率的變化反映了溶液中的分析物與固定在表面上的與配體結(jié)合的分析物質(zhì)的量[18]。SPR原理如圖1所示。

圖1 表面等離子共振(SPR)原理圖[18]Fig.1 Theory of surface plasmon resonance (SPR)[18].

偏振光以一定角度范圍入射到鍍?cè)诓ＡП砻娴谋∧ど习l(fā)生全反射，會(huì)形成消逝波進(jìn)入光疏介質(zhì)，而在光疏介質(zhì)中又存在等離子波，當(dāng)符合表面等離子體共振波的激發(fā)條件時(shí)，兩波相遇就可能發(fā)生共振(圖1)。入射光的能量被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)反射強(qiáng)度最低值，即共振吸收峰，所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為共振波長(zhǎng)，對(duì)應(yīng)的入射角為共振角，當(dāng)金屬薄膜表面介質(zhì)不同時(shí)，共振角或共振波長(zhǎng)將改變，由此可獲得相關(guān)信息。SPR對(duì)附著在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率非常敏感，當(dāng)表面介質(zhì)的屬性改變或者附著量改變時(shí)，共振角會(huì)發(fā)生變化。因此，SPR譜(共振角的變化vs時(shí)間)能夠反映與金屬膜表面接觸的體系的變化[9-13]。

1.2 EC基本原理

EC檢測(cè)依托于三電極體系：工作電極(working electrode)、參比電極(reference electrode)和對(duì)電極(auxiliary electrode)。在電化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)物在電解液或電極修飾層溶液的界面中得失電子，其大多是一種界面反應(yīng)。電極電流可以看作工作電位的函數(shù)，工作電極的電位相對(duì)于參比電極，電流流經(jīng)工作電極和對(duì)電極(圖2)。

1.3 EC-SPR聯(lián)用

在EC-SPR中,玻璃或石英基底上的金膜既被用來(lái)產(chǎn)生表面等離子體共振的介質(zhì)，又可以用作電化學(xué)測(cè)試的工作電極。在產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)的時(shí)候，電極溶液界面內(nèi)發(fā)生的任何性質(zhì)的變化都會(huì)引起SPR共振角(折射率)發(fā)生變化,這就是EC-SPR技術(shù)的基本原理(圖2)[19-21]。

圖2 EC-SPR原理圖[21]Fig.2 Theory of electrochemical surface plasmon resonance[21].

2 EC-SPR在DNA分析及其他方面的應(yīng)用進(jìn)展

2.1 循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)與SPR聯(lián)用在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用研究

CV除了作為定量分析方法外，更主要的是作為電化學(xué)方法，可用于研究電極反應(yīng)的性質(zhì)、機(jī)理及電極過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。在一個(gè)典型的循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)中，工作電極一般為浸在溶液中的固定電極。為了盡可能降低歐姆電阻，建議采用三電極系統(tǒng)。在三電極系統(tǒng)中，電流流經(jīng)工作電極和對(duì)電極。工作電極電位是一個(gè)分開(kāi)的參比電極(如飽和甘汞電極，SCE)為基準(zhǔn)的相對(duì)電位。在循環(huán)伏安測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，工作電極的電位以10～200 mV/s的掃描速度隨時(shí)間線性變化，與此同時(shí)記錄在不同電位下的電流。表面等離子共振技術(shù)旨在檢測(cè)表面附近折射率的變化。眾所周知，SPR是一種無(wú)標(biāo)記、實(shí)時(shí)、靈敏和快速的方法，用于研究分子相互作用[22-25]的動(dòng)力學(xué)和效率常數(shù)、大分子的構(gòu)象變化[26-27]等。傳統(tǒng)的SPR由于無(wú)法測(cè)量折射率的極小變化而在超靈敏檢測(cè)中的應(yīng)用受到限制。而這兩者的結(jié)合，可以監(jiān)測(cè)電化學(xué)反應(yīng)中的大范圍氧化還原反應(yīng)過(guò)程，不但可以研究聚合物的電化學(xué)行為，還可以分析電極表面的結(jié)合、解離和擴(kuò)散過(guò)程。Liu等[28]報(bào)道了一種基于二茂鐵-鏈霉抗生物素蛋白(Fc-Stv)綴合物的靈敏方法，用于將EC和SPR的DNA靶標(biāo)同時(shí)雜交至金表面修飾的肽核酸上。Fc-Stv與生物素化的互補(bǔ)靶DNA的連接不僅放大了SPR信號(hào)，而且由于每個(gè)Stv具有許多Fc標(biāo)記物，也增強(qiáng)了電化學(xué)信號(hào)。二茂鐵氧化還原峰電流隨靶DNA濃度的增加而增加。因此，可以通過(guò)CV估計(jì)雜交的靶DNA的量。該傳感器還顯示出高選擇性(在單堿基錯(cuò)配水平下)和良好的重現(xiàn)性。Patskovsky等[29]以亞甲基藍(lán)(MB)有機(jī)染料為例，通過(guò)CV進(jìn)行表征，研究了電化學(xué)SPR(ESPR)傳感的理論和實(shí)驗(yàn)參數(shù)。他們還評(píng)估了在溶液中以及在由標(biāo)記有MB的莖環(huán)寡核苷酸形成的均勻界面薄膜中用于MB傳感的最佳ESPR實(shí)驗(yàn)方法。光學(xué)SPR響應(yīng)的電化學(xué)激活依賴于局部MB濃度，可用于設(shè)計(jì)敏感和高選擇性的生物傳感方法。

2.2 電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy，EIS)與SPR聯(lián)用在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用研究

EIS描述了系統(tǒng)對(duì)周期性小幅度交流信號(hào)的應(yīng)用的響應(yīng)，用于分析由表面上帶電生物分子結(jié)合誘導(dǎo)的修飾電極和半導(dǎo)體的界面特性的變化，是SPR的一個(gè)有用的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)工具。EIS可以在導(dǎo)電聚合物[30-31]、金屬[32-37]、半導(dǎo)體界面[37-41]以及異質(zhì)結(jié)構(gòu)如半導(dǎo)體/介電界面(例如硅/二氧化硅)[40,42-45]上進(jìn)行。Vogt等[46]在兩個(gè)鍍金的SPR玻片上單獨(dú)進(jìn)行了EIS和SPR聯(lián)合測(cè)量，證明了從FeRi/亞鐵氰化物氧化還原偶中釋放的游離CN-會(huì)蝕刻金表面的猜測(cè)。Wang等[47]報(bào)道了一種基于石墨烯的無(wú)標(biāo)記、再生和靈敏的表面等離子共振(SPR)和電化學(xué)適體傳感器，用于檢測(cè)α-凝血酶。無(wú)標(biāo)記的EIS適體傳感器表現(xiàn)出高選擇性，證實(shí)了適體傳感器良好的靈敏度和選擇性，可用于制備靈敏的EIS適體傳感器檢測(cè)α-凝血酶，從而為設(shè)計(jì)高性能電化學(xué)適體傳感器提供了一種新方法。值得一提的是，與CV相比，EIS的優(yōu)勢(shì)在于其非侵入性[48]。在CV的情況下應(yīng)用潛在的斜坡會(huì)導(dǎo)致與表面相連的分子發(fā)生不可逆的氧化。因此，通過(guò)研究氧化還原探針在緩沖溶液中的擴(kuò)散或通過(guò)記錄雜交前后DNA層的阻抗變化，EIS已成功應(yīng)用于DNA雜交研究[49-50]。但是在EIS中經(jīng)常遇到的一個(gè)問(wèn)題是難以確定從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得的電路模型的唯一性。與SPR測(cè)量(SPR/EIS)的聯(lián)合應(yīng)用有助于克服這一缺陷。因此，使用EIS檢測(cè)雙分子的相互作用已被應(yīng)用于生物傳感器的開(kāi)發(fā)[51-52]。

2.3 CV/EIS與SPR聯(lián)用在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用研究

CV和EIS都是研究電極過(guò)程的最常用方法，除了單獨(dú)和SPR技術(shù)聯(lián)用外，近些年來(lái)CV、EIS共同與SPR聯(lián)用的方法也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。Lee等[53]利用電化學(xué)方法(EC)和局域表面等離子體共振(LSPR)方法，通過(guò)CV/EIS技術(shù)在Au納米晶體(AuNC)上制備了由多功能DNA(MF-DNA)組成的雙模心肌鈣蛋白I(CTnI)生物傳感器。這種簡(jiǎn)單的納米結(jié)構(gòu)提供了更高的表面覆蓋率，便于增加固定化時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)更大的靶標(biāo)-生物探針結(jié)合。此外，該工藝不需要復(fù)雜的生物傳感器制造方法，最終減少了生物傳感器的制造時(shí)間。Zhang等[54]報(bào)道了CV/EIS與SPR聯(lián)用方法在檢測(cè)大腸桿菌細(xì)胞表面上貼壁細(xì)胞和DNA吸收的應(yīng)用，通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)、CV和EIS表征活細(xì)胞在表面上的附著，并計(jì)算CV和SPR信號(hào)獲得吸收的動(dòng)態(tài)參數(shù)。在這項(xiàng)工作中，利用多肽RGD對(duì)金顆粒的結(jié)合特異性，將大腸桿菌細(xì)胞靶向結(jié)合在金表面。然后通過(guò)電化學(xué)方法以及該固定化方案的表面等離子體共振光譜研究細(xì)胞外鯡魚(yú)精子DNA在大腸桿菌上的吸附動(dòng)力學(xué)。重要的是，這是第一項(xiàng)使用電化學(xué)方法表達(dá)大腸桿菌對(duì)DNA吸附作用的研究。最終結(jié)果表明，聯(lián)用方法適用于檢測(cè)微生物表面上的DNA結(jié)合，并且平衡常數(shù)的結(jié)果是精確可靠的。

2.4 EC-SPR在其他方面的應(yīng)用

綜上，可以看出電化學(xué)和SPR兩種技術(shù)的聯(lián)用呈現(xiàn)出多樣化的趨勢(shì)，隨著EC-SPR研究的不斷深入,應(yīng)用范圍也在逐漸擴(kuò)大。本小節(jié)將根據(jù)EC-SPR在研究細(xì)胞色素C(Cyt C)的氧化還原對(duì)和細(xì)胞色素C氧化酶(COX)之間的相互作用、癌細(xì)胞以及水中氨芐青霉素的檢測(cè)等方面的應(yīng)用對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行評(píng)述。

Hou[55]等通過(guò)電化學(xué)表面等離子共振(EC-SPR)系統(tǒng)在模擬氧化還原調(diào)節(jié)的界面上研究細(xì)胞色素C(Cyt C)的氧化還原對(duì)和細(xì)胞色素C氧化酶(COX)之間的相互作用。在該研究中，原位EC-SPR有望更好地模擬COX嵌入線粒體內(nèi)膜的體內(nèi)條件。而且，利用Cyt C在流動(dòng)相中充當(dāng)電子穿梭物，是研究氧化還原依賴性生物分子相互作用的有效方法。Wu等[56]采用EC-SPR研究的策略來(lái)評(píng)估在SPR芯片界面上用DNR處理的癌細(xì)胞。從SPR記錄的信號(hào)變化是由吸附的HepG2細(xì)胞的形態(tài)和質(zhì)量變化以及培養(yǎng)基溶液的折射率變化引起的。培養(yǎng)基中細(xì)胞外的DNR殘留濃度可通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)定。光學(xué)顯微鏡圖像和MTT測(cè)試的結(jié)果還證明,相關(guān)細(xì)胞的釋放或解吸是由DNR處理后癌細(xì)胞的凋亡引起的。SPR信號(hào)幅度的降低與細(xì)胞存活率線性相關(guān)。觀察表明SPR與電化學(xué)研究的組合可用于評(píng)估細(xì)胞中生物活性劑的治療效率。因此，這種無(wú)標(biāo)記的實(shí)時(shí)EC-SPR方法在監(jiān)測(cè)相關(guān)臨床治療過(guò)程和藥物分析方面具有巨大的應(yīng)用潛力。Wu等[57]建立了一種基于SPR的檢測(cè)方法，應(yīng)用EC對(duì)氨芐青霉素檢測(cè)中使用的適體平臺(tái)進(jìn)行精制和表征?；贏PT修飾的金芯片的新型SPR方法被開(kāi)發(fā)用于AMP的選擇性、靈敏、實(shí)時(shí)和無(wú)標(biāo)記測(cè)定。通過(guò)潛在的脈沖電化學(xué)方法改善了在特定APT的金芯片上的固定。通過(guò)SPR、CV、EIS和石英晶體微天平分析表征了適體傳感器精制的每個(gè)步驟。經(jīng)開(kāi)發(fā)的適體傳感器被證明對(duì)AMP檢測(cè)具有選擇性，且?guī)缀醪皇芷渌股睾退幬锏挠绊?，并已成功用于河水中AMP的檢測(cè)。

3 展望

SPR對(duì)金屬膜上發(fā)生的各種反應(yīng)高度敏感，并且已經(jīng)成為研究在表面上發(fā)生的分子結(jié)合過(guò)程的強(qiáng)有力的無(wú)標(biāo)記方法。另一個(gè)重要但較少探索的應(yīng)用領(lǐng)域是使用EC-SPR聯(lián)合，該方法將EC與光學(xué)方法結(jié)合，使EC和SPR技術(shù)特點(diǎn)相互補(bǔ)充，雖然二者都是研究界面及界面附近物質(zhì)的變化，但信號(hào)的來(lái)源各不相同，EC為電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，SPR為折射率的變化。EC-SPR聯(lián)用技術(shù)相比于單一技術(shù)，能夠得到綜合且全面的信息。而SPR芯片的金膜又可以作為EC的工作電極，通過(guò)對(duì)樣品流動(dòng)池的簡(jiǎn)單改造便可搭建三電極電化學(xué)池。兩種技術(shù)聯(lián)用對(duì)于研究在電極表面上發(fā)生的非均相反應(yīng)，以及用于測(cè)量反應(yīng)物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，這可以幫助識(shí)別反應(yīng)機(jī)理從而更好地監(jiān)測(cè)和理解生化過(guò)程。同時(shí)，EC-SPR聯(lián)合跳出了SPR聯(lián)用技術(shù)中簡(jiǎn)單結(jié)合的思路，能夠在更深層次上認(rèn)識(shí)SPR信號(hào)與EC信號(hào)的關(guān)系，搭建起兩種信號(hào)之間的紐帶。

值得一提的是，近期SPR技術(shù)相關(guān)的研究多數(shù)依賴于成熟的商業(yè)化設(shè)備，由于此類設(shè)備系統(tǒng)較為封閉，且芯片試劑等材料均為設(shè)備公司提供，阻礙了EC-SPR聯(lián)用方面的研究，且儀器昂貴，不便于推廣。隨著功能納米材料微型化、新特性和新功能的需求日益增長(zhǎng)，多技術(shù)聯(lián)用方面的應(yīng)用前景越來(lái)越廣闊。EC-SPR和其他技術(shù)(例如：高效液相色譜、光學(xué)顯微技術(shù)、原子顯微鏡等)進(jìn)一步聯(lián)用的相關(guān)研究會(huì)逐步深入，EC-SPR的應(yīng)用范圍也會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。接下來(lái)EC-SPR的儀器集成化、微型化和檢驗(yàn)自動(dòng)化或?qū)⒊蔀槲磥?lái)開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)。