羅 強,劉衛(wèi)平,龍乾發(fā),張胡金,柴 源,苗 宇,伊西才

(1西安市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710003;2空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:Liuwp@fmmu.edu.cn)

高原脫適應反應的發(fā)病機制尚未完全清楚,也無有效的防治措施。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是人體對低氧刺激最敏感、耐受性最差的部位,高原低氧對其影響不言而喻。Fischer等[1]研究證實,缺氧可損傷血腦屏障(blood brain barrier,BBB),引起腦血管通透性增高,使細胞間的異常漏出增多而發(fā)生水腫。組織缺氧會刺激CD34+細胞代償性增加并分化為內(nèi)皮細胞而形成新生血管[2]。因此,腦微血管密度(microvessel density,MVD)的代償性增加及BBB通透性增高與高原病的發(fā)生關系密切。而在脫離高原環(huán)境進入常氧環(huán)境后,腦MVD及BBB通透性會發(fā)生怎樣的變化?本研究通過建立實驗性低壓低氧大鼠模型,探討在脫適應期腦MVD和BBB通透性的改變及與返回常氧環(huán)境時間的關系,旨在為高原脫適應反應的發(fā)病機制及防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5-6周齡雄性SD大鼠72只,清潔級,由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(軍)2007-007,體質(zhì)量150～200 g,隨機分為低壓低氧大鼠模型組與常氧環(huán)境對照組,根據(jù)返回常氧環(huán)境不同時間模型組又分為5個亞組,每組12只大鼠。

1.2 主要試劑和設備

伊文氏藍(Evans blue,EB)及甲酰胺均購于美國Sigma公司,單克隆兔抗大鼠CD34抗體(BA0532)購自于武漢博士德生物有限公司,免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑購自北京中杉金橋公司。高原環(huán)境模擬艙為貴州風雷航空軍械有限公司,紫外分光光度儀為德國Sartotius公司產(chǎn)品。

1.3 動物模型制備

模型組大鼠放入模擬海拔4 000 m的高原環(huán)境模擬艙,氧濃度為12.6%,溫度25 ℃,光照周期12 h,自由飲食水,定時向高原環(huán)境模擬艙內(nèi)添加水、鼠糧、更換墊料。在高原環(huán)境模擬倉飼養(yǎng)4周后將其移至常氧環(huán)境,分別在至常氧環(huán)境后1,3,7,14,30 d,分別檢測每個亞組腦組織BBB通透性及CD34表達量。

1.4 伊文氏藍(EB)示蹤法測定血腦屏障通透性

伊文氏藍(EB)標準曲線繪制:按照倍率稀釋法建立EB的標準曲線,配置質(zhì)量濃度10 mg/100 ml的原始EB溶液,以甲酰胺作為空白對照調(diào)零液,依次稀釋形成質(zhì)量濃度為10,5,2.5,1.25,0.625,0.312 5,0.156 3 μg/ml濃度梯度的標準溶液,60 ℃水浴孵育24 h，測定波長625 nm處EB的吸光度(OD)值，繪制EB標準曲線，計算線性回歸方程。

腦組織EB含量的測定:使用EB作為檢測BBB通透性的示蹤劑,對照組及每個亞組內(nèi)隨機取6只大鼠,尾靜脈注入2% EB(2 ml/kg)。在注入EB幾分鐘后,可見大鼠眼球結膜、唇、四肢等顯示深藍色,表示EB注射進入體循環(huán)。2 h后用250 ml預冷肝素生理鹽水灌注心臟,直至流出液顏色清亮,迅速取大鼠腦組織,稱重后機械性粉碎濕腦組織,按每100 mg濕腦組織加3 ml甲酰胺加蓋避光,60 ℃水浴24 h，3 000 r/min離心20 min，檢測樣本上清液的OD625 nm值，根據(jù)線性回歸方程計算出各樣本中EB的濃度，求得腦組織EB的含量(μg/g濕腦組織)。

1.5 免疫組化法檢測CD34的表達

到達取材時間后取每組剩余6只大鼠,10%水合氯醛麻醉后行左心室插管,依次用預冷肝素生理鹽水、4%的多聚甲醛灌注后取腦,所有腦組織立即放入10%多聚甲醛溶液固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,2 μm厚連續(xù)切片。免疫組化采用SP(streptavidin perosidase)法,切片常規(guī)梯度脫蠟至水,檸檬酸溶液中高溫高壓抗原修復100 s,3%H2O2溶液封閉20 min。山羊血清封閉1 h,滴加一抗,4 ℃孵育過夜，PBS沖洗,分別滴加生物素標記的山羊抗兔二抗,室溫孵育30 min,滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素,室溫孵育20 min,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復染,中性樹膠封片,陰性對照用PBS代替一抗。光學顯微鏡下,血管內(nèi)皮細胞核膜棕褐色為CD34+細胞,每組選10張切片,每張切片高倍鏡下(×400)在皮質(zhì)區(qū)隨機取不重疊的5-10個視野進行CD34+細胞計數(shù),染成棕褐色的有核細胞均視為陽性細胞,最后取高倍視野微血管數(shù)的平均值作為該組腦MVD值。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

低壓低氧模型組大鼠腦組織EB含量較對照組明顯增加,以返回常氧環(huán)境第1天最為顯著(P<0.01),在脫離低壓低氧環(huán)境后,腦組織EB含量隨著返回常氧環(huán)境時間的延長而逐漸呈降低的趨勢,與返回時間呈顯著負相關(r=-0.898,P=0.038),而模型組大鼠在返回常氧環(huán)境30 d時腦組織EB含量仍然高于對照組水平(P<0.05,見圖1,2),表明BBB通透性尚未完全恢復到正常水平。與BBB通透性的變化一致,低壓低氧模型組大鼠腦MVD(CD34+細胞數(shù))與對照組相比明顯增多(P<0.01),在脫離低氧環(huán)境早期時最為明顯,腦MVD的變化與返回常氧環(huán)境時間呈高度負相關(r=-0.883,P=0.016);模型組在返回常氧環(huán)境30 d時也高于對照組水平(P<0.05，見圖1,2),表明腦MVD的改變?nèi)蕴幵诿撨m應期。

圖1 低壓低氧模型組大鼠返回常氧環(huán)境后CD34+細胞的表達變化 (×400)

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

脫適應癥是人體脫離高原低氧進入常氧環(huán)境后的一種適應性反應,會伴隨一系列的生理反應和臨床表現(xiàn),其主要癥狀有疲倦、乏力、嗜睡、胸悶、氣短、頭昏、腹脹、腹瀉等[3-7]。近年來,高原地區(qū)與平原地區(qū)交流更加廣泛,加之參加青海玉樹等高原地區(qū)抗震救災官兵返回平原后出現(xiàn)的脫適應反應,使得高原脫適應反應越來越受到醫(yī)學界的關注[8]。

BBB是中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血循環(huán)之間物質(zhì)交換的調(diào)節(jié)器,由腦毛細血管內(nèi)皮細胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構成的,對于維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定起到關鍵的作用,其通透性的改變是多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中常見的、較早發(fā)生的變化[9,10]。有研究顯示,高原低氧暴露對BBB及血管內(nèi)皮細胞的損傷使其通透性增高,血管內(nèi)滲出增多,腦組織含水量增加,表明高原腦水腫是一種血管源性水腫[11,12]。腦微血管是供給腦組織氧、營養(yǎng)必需物質(zhì)及相應量血液的傳送裝置,已有研究表明機體在受到低氧、缺血、損傷等刺激時,作為一種保護性因素的腦MVD會代償性增加,而CD34+細胞在過程中發(fā)揮著重要的作用,CD34+細胞是一類具有自我更新,多向分化及重建造血和免疫的內(nèi)皮祖細胞,在促進血管新生、組織修復、創(chuàng)傷愈合等方面發(fā)揮著重要的作用[13]。在機體受到低氧、損傷等刺激時,CD34+細胞會代償性增加。Gong等[14]報道,在CD34+細胞聚集的過程會伴隨著血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素等促血管生成因子的分泌增加,血管內(nèi)皮生長因子能夠促進基質(zhì)金屬蛋白酶9的活化,抑制緊密連接蛋白的表達,從而增加BBB的通透性,加重腦水腫。由此可見在機體受到低氧、損傷等刺激時CD34+細胞的增多與BBB通透性及腦水腫密切相關[15]。

本次研究結果顯示,低壓低氧大鼠在重返平原后BBB通透性及腦MVD較對照組明顯增加,隨著返回時間的延長均呈降低的變化趨勢。石自福等[8]曾報道,脫適應反應癥狀多出現(xiàn)返回平原后1周,大多癥狀在一個月內(nèi)逐漸減退并消失,但有些持續(xù)時間較長甚至反復出現(xiàn)。Pichiule等[16]發(fā)現(xiàn)大鼠從高海拔缺氧環(huán)境返回常氧環(huán)境后短時間內(nèi)血細胞數(shù)量及腦MVD依然較高,保持了較強的輸氧能力,使組織處于高氧狀態(tài),在返回常氧環(huán)境后,腦微血管內(nèi)皮細胞的凋亡增加以降低大腦MVD。本研究結果證實,BBB通透性及腦MVD的改變以返回常氧環(huán)境早期時最為顯著,與高原脫適應反應發(fā)生有時間上的一致性。因此,高原脫適應反應的發(fā)生可能與低壓低氧引起的BBB通透性及腦MVD的改變有關。BBB通透性增加,屏障功能減弱,可促使腦水腫的形成,也可使一些代謝有害物質(zhì)大量進入腦組織,破壞了神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定;腦MVD的增加使得腦組織處于一種相對高氧的狀態(tài),出現(xiàn)“醉氧”的一些癥狀。在返回常氧環(huán)境30 d時,BBB通透性及腦MVD仍然高于對照組,表明高原脫適應是一個相對漫長的過程,要完全脫適應需要更長的時間。

本次研究從神經(jīng)系統(tǒng)BBB通透性及腦MVD在脫適應期的改變進行分析,為預防和治療脫高原適應反應及藥物研發(fā)提供了理論基礎。然而,高原脫適應反應是神經(jīng)、血液、循環(huán)、呼吸、內(nèi)分泌等多個系統(tǒng)共同參與的全身性疾病,要完全闡明脫適應反應的發(fā)病機制并制定有效的防治措施,需要進一步深入研究。