史喜玉 孫金霞 馬桂芳 楊李 潘夢(mèng)丹

摘 ?要：目的 ?分析過(guò)敏性哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）患者IL-4的表達(dá)及IL-4基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與哮喘遺傳易感性的關(guān)系。方法 ?應(yīng)用ELISA法檢測(cè)67例過(guò)敏性哮喘患者和85例對(duì)照組的血清中IL-4的表達(dá)情況，采用測(cè)序的方法檢測(cè)兩組中IL-4基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位點(diǎn)的基因分型情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 ?實(shí)驗(yàn)組患者血清IL-4的表達(dá)增高，P<0.05;4個(gè)SNP各基因型在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中沒(méi)有明顯差異，P>0.05。結(jié)論 ?患者血清中IL-4的表達(dá)增高，rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250多態(tài)性與IL-4的表達(dá)增高沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)。

關(guān)鍵詞：哮喘 ?IL-4 ?ELISA ?SNP ?測(cè)序

中圖分類號(hào)：R562.25 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2019）10（c）-0218-03

過(guò)敏性哮喘是一種嚴(yán)重的過(guò)敏性疾病，是最常見(jiàn)慢性病之一。它的特點(diǎn)是氣管支氣管對(duì)多重刺激的反應(yīng)性增加，各種炎癥細(xì)胞特別是嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加，氣道上皮細(xì)胞損傷、氣道平滑肌肥厚，且血清總IgE升高。哮喘往往在夜間加劇，可進(jìn)展為嚴(yán)重的氣流阻塞、呼吸急促、呼吸困難和吸氧不足。如不及時(shí)治療，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的后果，如缺氧癲癇發(fā)作，呼吸衰竭，甚至死亡[1]，它也是當(dāng)今世界上最常見(jiàn)的慢性氣道炎癥性疾病。流行病學(xué)研究表明，全世界范圍內(nèi)呼吸道過(guò)敏的患病率高達(dá)15%～30%[1]，哮喘影響了3.5%～20%的人群[2]。

家系和雙子研究顯示哮喘的發(fā)病具有家族聚集性和明顯的遺傳傾向[3]，其遺傳度可達(dá)60%～80%。IL-4是Th2細(xì)胞分泌的，常見(jiàn)哮喘患者IL-4表達(dá)增高。目前國(guó)際上有多篇文獻(xiàn)報(bào)道IL-4的單核苷酸多態(tài)性（SNP）和哮喘的相關(guān)研究，但結(jié)果存在分歧。該研究設(shè)計(jì)對(duì)照病例研究，挑選IL-4基因的啟動(dòng)子區(qū)rs2243250（-589T/C）和rs2227284、 rs2070874、rs4986964四個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析研究，探討IL-4基因多態(tài)性多哮喘遺傳易感性的影響。

1 ?材料與方法

1.1 材料

研究材料為哮喘患者或正常對(duì)照外周血，取自鹽城周邊地區(qū)人群，病例組67例，平均年齡43.2±16.27，患者符合2009年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)哮喘學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對(duì)照組85例，平均年齡42.97±19.86，為同期健康體檢人員，無(wú)哮喘史，無(wú)過(guò)敏史。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA

每例全血3～5mL，3000rpm，10min分離上清，血清轉(zhuǎn)移至離心管，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。剩余血?xì)胞，采用全血DNA提取試劑盒（三博遠(yuǎn)志，離心柱型SG012）提取標(biāo)本血細(xì)胞DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ELISA法檢測(cè)血清IL-4的表達(dá)

每孔加100?L實(shí)驗(yàn)血清，密封并室溫下孵化2h;加入二抗，密封并室溫下培養(yǎng)1h;洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。加入生物素化抗體工作液100?L/孔，密封并室溫下孵化60min;洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。加入酶結(jié)合工作液100?L/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫孵育20min。洗板5次，最后一次置厚吸水紙上拍干。加入顯色劑TMB100?L/孔，避光室溫孵育20min;加入終止液50?L/孔，混勻后，用酶標(biāo)儀（450nm，Bio-Rad iMark） 即刻測(cè)定光密度（OD）值，測(cè)量OD450，并分析數(shù)據(jù)。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.2.3 設(shè)計(jì)引物

IL-4基因4個(gè)單核苷酸多態(tài)性SNP位點(diǎn)rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，交由上海生工生物有限公司合成引物。

1.2.4 PCR反應(yīng)進(jìn)行待測(cè)位點(diǎn)擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：模板1μL，引物F1μL，引物R1μL，10mMdNTP1μL，TaqBuffer5μL，25mMMgCl25μL，5U/μLTaq酶l0.5μL，水35.5μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃，3min，變性94℃，30s，退火55℃～60℃，35s;延伸72℃，40～50s，修復(fù)延伸72℃，循環(huán)35次。最后1%瓊脂糖電泳，150V、100m、A20min電泳觀察。采用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工SK1141），然后進(jìn)行基因測(cè)序，鑒定位點(diǎn)的基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將病例組和對(duì)照組基因型頻數(shù)進(jìn)行哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗(yàn)，之后進(jìn)行采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 DNA提取后電泳結(jié)果

收集哮喘患者及正常人體檢血液標(biāo)本，分離血清，血細(xì)胞。血清至于離心管中，-20℃保存。剩余血細(xì)胞，采用全血DNA提取試劑盒提取標(biāo)本血細(xì)胞DNA，電泳鑒定見(jiàn)圖1。

2.2 ELISA法檢測(cè)患者及對(duì)照組血清IL-4的表達(dá)

ELISA法檢測(cè)67例患者及85例對(duì)照IL-4的蛋白表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組IL-4的表達(dá)值為（0.75±0.19）pg/mL，對(duì)照組表達(dá)值為（0.39±0.13）pg/mL，P<0.05。

2.3 IL-4基因SNP篩選及測(cè)序鑒定鑒定

根據(jù)rs2227284、rs2070874、rs4986964、rs2243250位點(diǎn)的DNA序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，結(jié)果見(jiàn)表2。之后進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳驗(yàn)證后，用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（生工SK1141），測(cè)序并分析（見(jiàn)表3）。在4個(gè)SNP位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中無(wú)明顯差異，P>0.05。

3 ?討論

基因多態(tài)性是指在人群中個(gè)體間基因的核苷酸序列存在差異，即人類染色體的某個(gè)位點(diǎn)上單個(gè)核苷酸變異，且在人群的發(fā)生頻率超過(guò)1%，稱為單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。人類基因組中SNP數(shù)量眾多，平均每300～1000個(gè)堿基中就存在一個(gè)SNP。由于SNP分布廣泛并且相對(duì)穩(wěn)定，是人類個(gè)體差異主要的分子標(biāo)記，因此，常用于反應(yīng)個(gè)體表型差異、不同個(gè)體對(duì)疾病易感性以及不同個(gè)體對(duì)藥物敏感性的研究[4]。

哮喘的主要免疫特征是過(guò)度的Th2反應(yīng)的Th1/Th2平衡紊亂作為重要的Th2因子，IL-4可以直接促進(jìn)IgE合成，因此在哮喘的病理生理過(guò)程中扮演重要角色[5]。

該研究通過(guò)病例對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)患者血清IL-4的表達(dá)增高，通過(guò)檢測(cè)IL-4的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，發(fā)現(xiàn)在病例和對(duì)照中無(wú)明顯差異。但此次研究樣本量偏少，頻率低的基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果可能有偏頗，擴(kuò)大樣本量能更好地反映實(shí)際情況。

參考文獻(xiàn)

[1] 孫金霞，周鷹，楊李，等.粉塵螨變應(yīng)原Der f Mal f 6的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2013，8（6）：530-534.

[2] 孫金霞，崔玉寶.哮喘的遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2014，20（1）：3-7.

[3] 楊李，周鷹，王運(yùn)剛，等.粉塵螨變應(yīng)原第1組分原核表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF-Der f 1構(gòu)建及鑒定[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2012，23（4）：289-291.

[4] DA， Srinivasan M， Egholm M. The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequeneing[J].Nature，2008，452（7189）：872-876.

[5] EI Biaze M，Boniface S，Koscher V，et al. T cell activation， from atopy to asthma： more a paradox than a paradigm[J].Allergy，2003，58（9）：844-853.