于蘭英 劉恬恬 付雙 劉晟 舒楠淇 杜艷偉 孟艷

尿素是哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)分解代謝的主要終末產(chǎn)物，具有高水溶性及低脂溶性，在肝臟內(nèi)合成并濃縮在哺乳動(dòng)物的腎臟中。尿素在哺乳動(dòng)物肝臟內(nèi)合成的過程，被稱為尿素循環(huán)，為哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)必須環(huán)節(jié)。尿素循環(huán)的主要目的是合成組織細(xì)胞活動(dòng)所需的一氧化氮和多胺等，并在這個(gè)過程中催化精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸。研究人員在哺乳動(dòng)物的心臟中也發(fā)現(xiàn)了部分尿素循環(huán)，有實(shí)驗(yàn)表明小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)尿素的堆積能促使小鼠發(fā)生心肌肥大。本研究擬利用心肌細(xì)胞（H9C2）建立高尿素模型，探討高尿素對心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 H9C2 細(xì)胞由上海拜力生物科技有限公司提供，DMEM 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清由美國Gibco 公司提供，蛋白裂解液由美國Sigma 公司提供，RIPA 緩沖液由美國Boston BioProducts 公司提供，BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒、ECL 顯色液由美國賽默飛世爾科技提供，心房利鈉尿多肽（atrial natriuretic polypeptide，ANP）一抗、β-actin 抗體、羊抗兔IgG 二抗（北京博奧森公司，產(chǎn)品編號：bs-2040R、bs-0061R、bs-0295G），PVDF 膜（美國Millipore 公司），油紅O 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），總膽固醇（TCH 酶法）測試盒、甘油三酯（TG 酶法）測試盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2 細(xì)胞用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素以及0.1mg/ml 鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，取對數(shù)生長期的H9C2 細(xì)胞進(jìn)行鋪板，使各皿內(nèi)細(xì)胞密度相等，24h 后模型組加入20mM 尿素，對照組加入1%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS），繼續(xù)培養(yǎng)。處理后分別于24、48及72h 提取細(xì)胞蛋白并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 H9C2 細(xì)胞ANP 表達(dá)水平檢測 采用蛋白免疫印跡法檢測心肌細(xì)胞ANP 表達(dá)水平。收取H9C2細(xì)胞，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中裂解。通過離心獲得上清液，抽取出的蛋白使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行蛋白定量。用12%SDS-PAGE 凝膠分離等量的蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶中封閉1h，并在4℃下與適當(dāng)濃度的一抗孵育過夜。次日用TBST 洗膜3 次后加入適當(dāng)濃度稀釋的二抗，室溫下繼續(xù)孵育1h 后將膜用TBST 洗滌3次，加入ECL 顯色液進(jìn)行顯色，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用圖像分析軟件（Image J）分析條帶的密度。

1.2.3 H9C2 細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài)觀測 通過油紅O 染色方法，觀察心肌細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài)。分別取對照組與24、48、72h 的模型組細(xì)胞進(jìn)行觀察。移除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞后用60%異丙醇固定，加入油紅染料對細(xì)胞內(nèi)脂滴進(jìn)行染色，后加入Mayer 蘇木素染色液對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，棄去染色液，加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）下進(jìn)行觀察，拍照。

1.2.4 H9C2 細(xì)胞內(nèi)脂類含量測定 采用德國奧芬堡FLUOstar Omega 酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)脂類含量。分別取對照組與24、48、72h 的模型組細(xì)胞進(jìn)行觀察。采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中進(jìn)行細(xì)胞裂解，冰水浴條件下超聲破碎，制備好的勻漿液不離心，直接吸取加入96 孔板，總膽固醇、甘油三酯于510nm 波長測定，HDL-C、LDL-C 于570nm 波長測定。所剩勻漿進(jìn)行BCA 蛋白定量。最終結(jié)合測定結(jié)果與BCA 定量結(jié)果計(jì)算細(xì)胞內(nèi)各脂類含量。所得數(shù)據(jù)使用GraphPad 進(jìn)行處理，并繪制柱形圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，各組內(nèi)均數(shù)比較采用post hoc 分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H9C2 細(xì)胞ANP 表達(dá)水平比較 見圖1。

圖1 H9C2 細(xì)胞ANP 表達(dá)水平比較（注：*P＜0.05）

由圖1 可見，與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞ANP 表達(dá)水平顯著增高，且隨時(shí)間呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 H9C2 細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài) 見圖2。

由圖2 可見，與對照組比較，24h 模型組心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。

2.3 H9C2 細(xì)胞內(nèi)脂類含量變化 見圖3。

由圖3 可見，與對照組比較，模型組心肌細(xì)胞總膽固醇、甘油三酯，HDL-C、LDL-C 含量均明顯增高，組內(nèi)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖2 H9C2 細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài)（A：對照組；B：24h 模型組；油紅O染色，×400）

圖3 H9C2 細(xì)胞內(nèi)各類脂質(zhì)含量

3 討論

心肌肥大作為心臟的一種強(qiáng)而有力的代償形式，是心臟疾病進(jìn)展的主要預(yù)后因子之一，臨床上常常將其與高血壓、心力衰竭以及缺血性心臟病等多種心臟疾病相聯(lián)系，長期心肌肥大增加了心臟衰竭和猝死的危險(xiǎn)性[1-4]。到目前為止，人們主要將神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度活化作為心肌肥大和心力衰竭預(yù)防與治療的靶點(diǎn)，臨床上血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、β 受體阻滯劑以及醛固酮拮抗劑也被廣泛應(yīng)用到疾病治療的過程中，這些治療手段無疑減緩了患者的痛苦及臨床表現(xiàn)，延緩了心肌疾病的進(jìn)程，但無法阻止其惡化的過程[5-6]。因此進(jìn)一步探討研究心臟疾病的機(jī)制，以制定相應(yīng)的干預(yù)措施，仍然是研究人員的主要任務(wù)之一。

心臟是一個(gè)高耗能器官，通過對各種外源性底物的應(yīng)用產(chǎn)生能量，這個(gè)過程受到底物濃度、氧的供應(yīng)和心血管系統(tǒng)激素水平的影響，而在心臟面對各種刺激的情況下，心臟能彈性選擇用于供能的底物[9]，從而保持能量功能與心臟功能的平衡。常氧條件下，心臟中的ATP 主要來自于線粒體的氧化磷酸化和糖酵解，以及對脂肪酸和葡萄糖的利用。當(dāng)心肌喪失“自主”彈性選擇底物的能力，對于某種特殊底物的過分依賴，會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起心肌細(xì)胞的一系列病理性變化，加速細(xì)胞生長凋亡，最后致使心肌收縮舒張功能下降。在2004 年，Van Bilsen 提出心肌代謝重構(gòu)的概念，指出心臟在慢性超負(fù)荷以及底物供應(yīng)改變時(shí)，出現(xiàn)線粒體功能失調(diào)以及高能磷酸鹽代謝異常的現(xiàn)象[7-8]。隨后又有實(shí)驗(yàn)證明，在心肌肥大早期及心力衰竭的失代償期存在能量代謝障礙，在這個(gè)過程中最具特征的便是線粒體功能障礙。

尿素通道蛋白是尿素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，前期實(shí)驗(yàn)研究證明，尿素通道蛋白缺失導(dǎo)致小鼠心肌細(xì)胞尿素堆積。此外，尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除小鼠心肌活性氧產(chǎn)量增高，氧化應(yīng)激水平增加[9]。針對這些現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)選擇利用心肌細(xì)胞（H9C2 細(xì)胞）以及20mM尿素建立高尿素模型，探討高尿素對心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。研究結(jié)果表明，在高尿素負(fù)荷下，心肌重構(gòu)標(biāo)志蛋白ANP 表達(dá)水平增高，心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生明顯的脂肪堆積，與脂肪生成和運(yùn)送相關(guān)的脂類物質(zhì)含量也出現(xiàn)增加，并且這些現(xiàn)象隨時(shí)間呈遞增趨勢。這既是對之前一些研究的進(jìn)一步證實(shí)，也是為之后的研究提出了思路與建議。

本次研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示了高尿素可使得心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，可促進(jìn)心肌細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂，然而其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。我們有理由相信基于此方向的心肌疾病機(jī)制研究將為臨床治療心臟疾病提供新的靶點(diǎn)與策略，同時(shí)也為臨床開發(fā)新的不良反應(yīng)更小的治療藥物提供了思路。