劉 玥，陳守坤，王成微，李家偉，李海峰

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和逆境脅迫中起到了關(guān)鍵作用。MYB-MYC(R2R3-MYB and MYC transcription factors N-terminal)基因家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，其保守結(jié)構(gòu)域通常由2個(gè)部分組成，在其N端含有1個(gè)R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域[1]和1個(gè)MYC結(jié)構(gòu)域[2]。 迄今為止，在擬南芥和水稻中分別鑒定到5個(gè)AtMYB-MYC基因，如：AtMYC1[3]、AtMYC2[4]、AtMYC3、AtMYC4[5]和AtMYC5[6]以及2個(gè)OsMYB-MYC基因，如：OsMYC1[7]和OsMYC2[8]。這些基因廣泛參與擬南芥和水稻的生長發(fā)育以及響應(yīng)非生物脅迫[9]。但是MYB-MYC作為一個(gè)基因家族，在水稻基因組中仍然沒有鑒定和深入研究。

水稻是世界上重要的糧食作物之一[10]，作為禾本科模式植物，其基因組的組成比較簡單。2002年水稻基因組測序的完成，為水稻基因組學(xué)的研究提供了基礎(chǔ)[11]。水稻的基因組較小，易于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并且對其他禾本科植物如:二歲短柄草和小麥有良好的基因組共線性關(guān)系，水稻的基因組研究可以為其他禾本科植物的進(jìn)化關(guān)系提供理論依據(jù)[12]。鑒于此，本研究利用最新的水稻基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)方法，對水稻MYB-MYC基因家族在全基因組水平上進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步分析其染色體分布、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件、GO功能注釋、蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)、基因復(fù)制及表達(dá)模式，以期更好地了解MYB-MYC基因特性、進(jìn)化關(guān)系和基因功能，為研究MYB-MYC的基因功能提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 水稻MYB-MYC家族成員的全基因組鑒定

首先在Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.thml)中下載水稻的全基因組數(shù)據(jù)。同時(shí)在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中下載MYB-MYC_N結(jié)構(gòu)域(PF14215.6)作為搜索模型，利用HMM 3.0軟件篩選水稻中含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列。此外將水稻的全基因組蛋白質(zhì)序列構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫，使用TAIR數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)中擬南芥的MYB-MYC蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTP搜索。將上述2種方法篩選到的候選蛋白質(zhì)序列合并，去除重復(fù)、測序不完全和沒有完整編碼框的蛋白質(zhì)序列。利用Pfam和NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫對候選蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，去掉不完整結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列，最終得到水稻MYB-MYC基因家族序列。利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對水稻MYB-MYC蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、氨基酸長度和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；利用Cello軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[13]。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建、基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域序列分析

將水稻與其他植物的MYB-MYC蛋白質(zhì)整合，進(jìn)行多重序列比對；使用MEGA7軟件采用鄰接法(NJ)，Bootstrap值設(shè)置為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。使用MEME工具(http://meme-suit/org/)預(yù)測水稻的MYB-MYC蛋白質(zhì)序列中的保守序列位點(diǎn)。根據(jù)OsMYB-MYC基因的CDS序列和DNA基因組序列，利用在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.cn/)分析其基因結(jié)構(gòu)并進(jìn)行可視化。

1.3 啟動子順式作用元件和GO注釋分析

提取OsMYB-MYC基因上游1.5 kb的基因組序列，使用啟動子預(yù)測數(shù)據(jù)庫PlantCare(http://bioinformatice.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。將水稻MYB-MYC蛋白質(zhì)序列提交到Plant Transcriptional Regulatory Map[15]和PLAZA數(shù)據(jù)庫[16]中進(jìn)行GO注釋，整合得到的GO號，使用BGIWEGO進(jìn)行可視化[17]。

1.4 染色體定位、基因復(fù)制事件和共線性分析

根據(jù)水稻的基因組注釋信息(http://plants.ensembl.org/index.thml)獲得OsMYB-MYC基因的染色體位置信息。利用MCScanX軟件進(jìn)行基因復(fù)制分析[18]，最后使用Circos v 0.67軟件對染色體定位和共線性基因?qū)M(jìn)行可視化[19]。使用KaKs_calculator軟件[20]計(jì)算共線性基因?qū)Φ腒a/Ks值，用于評估其進(jìn)化選擇情況。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用同源蛋白分析的方法，將OsMYB-MYC基因在擬南芥中進(jìn)行比對，篩選出OsMYB-MYC在擬南芥中的直系同源基因，并提交到AraNetV2數(shù)據(jù)庫[21]中，進(jìn)一步得到蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，利用Cytoscape軟件[22]進(jìn)行可視化。

1.6 表達(dá)模式分析

使用NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)下載水稻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：即水稻的根(SRR1618549)、花藥(SRR1618546)、心皮(SRR1618547)和種子(SRR1618548)。使用TopHat和Cufflinks軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析[23]，計(jì)算OsMYB-MYC基因在不同組織中的FPKM值[24]。使用GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=)下載水稻在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達(dá)量數(shù)據(jù)，登錄號為GSE60287[25]。使用GEOquery軟件包分析OsMYB-MYC基因在干旱脅迫和鹽脅迫下的表達(dá)量。使用R語言Pheatmap軟件包對表達(dá)譜進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻MYB-MYC家族成員的鑒定

利用HMM和BLAST 2種比對方法，從水稻基因組中共鑒定出21個(gè)MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子作為候選基因。之后使用Pfam、NCBI-CDD 2個(gè)數(shù)據(jù)庫對得到的21條水稻MYB-MYC候選蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域完整性檢測，其中發(fā)現(xiàn)有17條具有完整的MYB-MYC保守結(jié)構(gòu)域，另外4條由于結(jié)構(gòu)域殘缺而被去除。最終得到的17條水稻MYB-MYC候選蛋白序列，占已注釋的水稻基因組的0.046%，并按照其位于染色體上的物理位置進(jìn)行命名(表1)。根據(jù)蛋白質(zhì)序列長度分析發(fā)現(xiàn)，水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子序列長度為180～904 aa，分子質(zhì)量為20.26～97.39 ku，其中OsMYB-MYC03含有最長的氨基酸序列，長度為904 aa，OsMYB-MYC08含有最短的氨基酸序列，長度為180 aa。轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位對于其功能具有借鑒作用。根據(jù)Cello在線軟件的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，所有的水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子都可以預(yù)測到亞細(xì)胞定位，其中11個(gè)定位于細(xì)胞核，4個(gè)定位于葉綠體，2個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)，極少數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)膜上。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

為了分析水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化關(guān)系，將22個(gè)擬南芥、10個(gè)二穗短柄草，49個(gè)小麥MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行合并，使用其全長蛋白質(zhì)序列，利用MEGA 7軟件中的NJ法，采用模型為泊松模型構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖1所示，根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支和bootstrap值，筆者將水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子家族分為Ⅰ、Ⅱ亞家族，每個(gè)亞家族可以分為若干個(gè)亞組。如：亞家族Ⅰ包括1、2、3亞組；亞家族Ⅱ包括了3、4、5亞組。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹，MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子在水稻，擬南芥，小麥，二穗短柄草中的同源性很高，表明MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子物種分化過程中非常保守。同時(shí)，所有的MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子都在單子葉和雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)，即MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子在單子葉植物和雙子葉植物中的聚類沒有偏好性。這表明，MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生的進(jìn)化時(shí)間要早于擬南芥、二穗短柄草、水稻和小麥的分化時(shí)間。

表1 水稻MYB-MYC基因家族基因的特征Table 1 Characterization of MYB-MYC gene family in rice

圖1 水稻、擬南芥、小麥和二穗短柄草MYB-MYC基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of MYB-MYC genes in rice,Arabidopsis, wheat and Brachypodium distachyon

通過對水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，共識別到兩類保守結(jié)構(gòu)域，分別為MYB-MYC保守結(jié)構(gòu)域和bHLH保守結(jié)構(gòu)域。每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都含有MYB-MYC保守結(jié)構(gòu)域，部分轉(zhuǎn)錄因子含有bHLH保守結(jié)構(gòu)域。利用MEME軟件對水稻MYB-MYC蛋白質(zhì)的保守基序組成和數(shù)目進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總共識別到10個(gè)保守基序motif，并依次命名為motif 1到motif 10。如圖2-c所示，motif 4和motif 6作為MYB-MYC結(jié)構(gòu)域的保守基序出現(xiàn)在所有的水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子中，motif 1 只出現(xiàn)在bHLH結(jié)構(gòu)域中，作為HLH結(jié)構(gòu)域的保守基序；motif 8存在于1、2、3亞組中，motif 9只存在于第5亞組中，這些基序可以作為識別不同亞組的標(biāo)志。這表明，MYB-MYC在進(jìn)化過程中，存在著內(nèi)部的分化，進(jìn)一步可能導(dǎo)致功能的分化。

為了進(jìn)一步預(yù)測基因功能和進(jìn)化關(guān)系，利用OsMYB-MYC基因的CDS和DNA基因組序列進(jìn)行了OsMYB-MYC基因結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，OsMYB-MYC基因的外顯子數(shù)量由1到10呈現(xiàn)不均勻分布。其中亞家族Ⅲ的外顯子數(shù)量多，平均含有10個(gè)外顯子。此外OsMYB-MYC13和OsMYB-MYC14只含有1個(gè)外顯子。

根據(jù)保守基序分析和基因結(jié)構(gòu)分析可知，雖然保守基序數(shù)量以及外顯子、內(nèi)含子長度有一定的差異，但是相同亞家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)高度保守。

圖2 水稻MYB-MYC基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化(a)、保守結(jié)構(gòu)域(b)、保守基序(c)和基因結(jié)構(gòu)(d)Fig.2 Phylogenetic relationships (a), conserved domain(b), conserved motifs(c) and gene structure(d) of MYB-MYC genes in rice

2.3 啟動子順式作用元件和GO注釋分析

為了更好地了解水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子的功能，將所有的水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因本體(Gene ontology)注釋。GO注釋主要包括細(xì)胞成分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)和生物過程(Biological process)3部分。如圖3所示，在細(xì)胞成分中， 70.6%的OsMYB-MYC蛋白參與細(xì)胞內(nèi)成分的構(gòu)成，少于60%的蛋白可參與植物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的構(gòu)成。在分子功能方面，超過80%的蛋白能夠與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，來發(fā)揮其在植物體內(nèi)的生物學(xué)功能；41.2%的OsMYB-MYC蛋白能夠參與雜環(huán)化合物的形成；少于20%的OsMYB-MYC蛋白具有催化作用。對水稻OsMYB-MYC蛋白參與的生物過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有52.9%的蛋白參與細(xì)胞進(jìn)程，47.1%的蛋白參與代謝以及生物調(diào)節(jié)過程，另有少于20%的OsMYB-MYC蛋白可在水稻信號傳導(dǎo)及逆境脅迫和植物生殖器官的發(fā)育中起到調(diào)控作用。通過上述結(jié)果，推測水稻OsMYB-MYC蛋白可通過與其他蛋白的結(jié)合，來調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)一些生物學(xué)過程，從而響應(yīng)一些非生物脅迫。

圖3 OsMYB-MYC蛋白的基因本體(GO)注釋分析Fig.3 Gene ontology annotation analysis of OsMYB-MYC proteins

順式作用元件是位于基因上游，與功能基因一起發(fā)揮作用的一類端的核苷酸序列，它們能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮作用。本研究中，截取水稻MYB-MYC基因上游1.5 kb的序列，對OsMYB-MYC基因的順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsMYB-MYC基因上游存在4大類型的順式作用元件。①調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)元件，如調(diào)控分生組織表達(dá)CAT-box。②光調(diào)節(jié)相關(guān)元件，如Box4元件、G-Box元件、GT1-motif元件、I-box元件、TCCC-motif元件和AE-box元件等。③響應(yīng)植物激素相關(guān)元件，如響應(yīng)植物激素的TGACG-motif元件，響應(yīng)ABA的ABRE元件，響應(yīng)水楊酸代謝的TCA-element元件，響應(yīng)赤霉素的P-box元件等。④響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)元件，如響應(yīng)厭氧反應(yīng)的ARE元件，響應(yīng)干旱反應(yīng)的MBS等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，17個(gè)水稻MYB-MYC基因上游發(fā)現(xiàn)了ABRE元件，其中OsMYB-MYC04含有11個(gè)ABRE元件，表明該轉(zhuǎn)錄因子可能參與水稻ABA代謝途徑。此外，光調(diào)節(jié)信號元件和激素響應(yīng)元件在水稻MYB-MYC基因上游發(fā)現(xiàn)較多，共有102個(gè)光調(diào)節(jié)信號元件和127個(gè)響應(yīng)植物激素元件，上述分析表明水稻MYB-MYC基因家族可能在調(diào)控植物生長發(fā)育、光調(diào)節(jié)、植物激素響應(yīng)及逆境脅迫等生理過程中具有重要的作用。

2.4 染色體定位和基因復(fù)制分析

根據(jù)水稻基因組gff3注釋文件，將鑒定得到了OsMYB-MYC基因進(jìn)行染色體定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4)，17個(gè)基因均可以定位到水稻的不同染色體上，每條染色體上大約有1～3個(gè)水稻MYB-MYC基因。

在基因的進(jìn)化以及分化過程中，基因復(fù)制在基因擴(kuò)張和基因的功能分化中發(fā)揮著重要作用。其中，基因復(fù)制包括串聯(lián)復(fù)制和并聯(lián)復(fù)制。在本試驗(yàn)中，使用MSCcanX軟件，對水稻全基因組進(jìn)行共線性分析，以此來分析水稻全基因組產(chǎn)生的基因復(fù)制事件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共產(chǎn)生5對并聯(lián)復(fù)制事件和3對串聯(lián)復(fù)制事件。證明MYB-MYC基因在水稻進(jìn)化過程中，基因復(fù)制使MYB-MYC基因家族進(jìn)行擴(kuò)張，但是擴(kuò)張緩慢，在進(jìn)化過程中十分保守。

在基因的進(jìn)化過程中，不導(dǎo)致氨基酸改變的核苷酸變異被稱為同義突變，反之則稱為非同義突變。主要包括：同義突變頻率(Ks)、非同義突變頻率(Ka)、非同義突變頻率與同義突變頻率的比值(Ka/Ks)。Ka/Ks對基因的進(jìn)化選擇有重要的指導(dǎo)作用，當(dāng)Ka/Ks>1，則認(rèn)為受到正向選擇作用，當(dāng)Ka/Ks=1，則認(rèn)為受到中性選擇，當(dāng)Ka/Ks<1，則認(rèn)為受到純化選擇。為了進(jìn)一步探討這些復(fù)制基因?qū)κ艿胶畏N選擇，對其進(jìn)行同義突變頻率(Ka)、非同義突變頻率(Ks)值的計(jì)算。通過計(jì)算，發(fā)現(xiàn)水稻MYB-MYC基因的串聯(lián)復(fù)制基因?qū)a/Ks值<1 (0.559)，水稻MYB-MYC基因的并聯(lián)復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks值<1(0.258)，說明OsMYB-MYC基因的復(fù)制基因?qū)υ谒具M(jìn)化過程中都受到純化選擇。

為了探索共線性基因?qū)Φ姆制鐣r(shí)間，使用Umarmasood等[26]的方法，對其分歧時(shí)間進(jìn)行計(jì)算。如表2所示，水稻MYB-MYC基因的串聯(lián)復(fù)制基因?qū)筒⒙?lián)復(fù)制基因?qū)Φ钠骄制鐣r(shí)間分別為27.19 Mya和94.89 Mya。上述結(jié)果表明并聯(lián)復(fù)制比串聯(lián)復(fù)制發(fā)生的更早，可能在進(jìn)化以及基因分化過程中起到重要的作用。

圖4 水稻MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子的基因定位和水稻基因組內(nèi)復(fù)制基因?qū)ig.4 Genomic locations of OsMYB-MYC TFs and duplicated gene pairs in rice

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

眾所周知，在植物體內(nèi)，很少有單個(gè)的蛋白質(zhì)能夠直接參與植物的生長發(fā)育和逆境脅迫反應(yīng)。大多數(shù)植物生理過程都是通過蛋白質(zhì)的相互作用來完成。為了更好地理解OsMYB-MYC的分子機(jī)制，構(gòu)建了OsMYB-MYC蛋白與其他水稻蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。如圖5所示，共有13個(gè)水稻MYB-MYC蛋白和29個(gè)水稻蛋白質(zhì)形成了58對蛋白互作關(guān)系。其中，OsMYB-MYC03、OsMYB-MYC05和OsMYB-MYC01分別與14、14、9個(gè)水稻蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用，其參與的蛋白互作范圍最大，占據(jù)總蛋白互作關(guān)系的63.7%，表明上述3個(gè)水稻MYB-MYC蛋白在蛋白互作中起到重要作用。

對水稻蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的基因進(jìn)行功能注釋后發(fā)現(xiàn)，這些互作蛋白屬于不同的基因家族，有著不同的生理功能。比如Os01g0105700、Os03g0591300、Os04g0301500等基因?qū)儆赽HLH基因家族，該基因家族能夠調(diào)控植物生長發(fā)育以及參與逆境脅迫等[27]；Os06g0622300，Os08g451400等屬于AT-rich基因家族，該基因家族能夠調(diào)控根系的生長[28]；Os04g0653000可以抑制植物激素茉莉酸的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且調(diào)控水稻小穗的發(fā)育[29]；Os09g0309700屬于TIFY3類蛋白，可以抑制乙烯的生物合成，與水稻抗旱生理有關(guān)[30]。以上結(jié)果表明，水稻MYB-MYC蛋白通過與其他蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)而參與到水稻生長發(fā)育、響應(yīng)植物激素及響應(yīng)干旱脅迫等代謝途徑。

表2 水稻MYB-MYC基因的基因復(fù)制信息及其Ka和Ks信息、基因分歧時(shí)間Table 2 The Ka/Ks ratios and divergence time for gene duplicated OsMYB-MYC genes

圖5 水稻MYB-MYC蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Interaction network of MYB-MYC proteins in rice

2.6 表達(dá)模式分析

為探究水稻MYB-MYC基因在水稻生長發(fā)育過程中潛在的生物學(xué)功能，本研究利用NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫下載水稻的根、花藥、心皮和種子4個(gè)組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，對水稻MYB-MYC基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究。如圖6-a所示，OsMYB-MYC基因表現(xiàn)出明顯的組織表達(dá)特異性；13個(gè)OsMYB-MYC基因在心皮中表達(dá)量較高，其中OsMYB-MYC09、OsMYB-MYC10、OsMYB-MYC17在心皮中表達(dá)量最高。有9個(gè)OsMYB-MYC基因在種子中表達(dá)量較高，其中OsMYB-MYC05、OsMYB-MYC07、OsMYB-MYC11在種子中表達(dá)量最高。OsMYB-MYC02、OsMYB-MYC03、OsMYB-MYC08在花藥中表達(dá)量最高。以上結(jié)果表明OsMYB-MYC基因可能在花發(fā)育過程以及種子形成或者萌發(fā)過程中發(fā)揮重要的功能。

同時(shí)為了研究OsMYB-MYC基因在逆境脅迫下的生物學(xué)功能，本試驗(yàn)利用GEO數(shù)據(jù)庫分析了水稻栽培種‘Nagina 22’在干旱和鹽脅迫下MYB-MYC基因的表達(dá)情況。如圖6-b所示，在干旱脅迫處理中OsMYB-MYC基因表達(dá)有明顯的變化，94.1%(16/17)的MYB-MYC基因表達(dá)量上調(diào)，其中OsMYB-MYC04和OsMYB-MYC11表達(dá)量有明顯的上調(diào)。在鹽脅迫處理中OsMYB-MYC基因表達(dá)也存在明顯的變化， 82.4%(14/17)的MYB-MYC基因表達(dá)量上調(diào)，其中OsMYB-MYC08、OsMYB-MYC16、OsMYB-MYC17表達(dá)量有明顯的上調(diào)。以上結(jié)果表明，OsMYB-MYC基因在響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫下具有重要作用。

圖6 OsMYB-MYC基因在不同組織中以及在干旱和鹽脅迫中的表達(dá)Fig.6 Expression profiles of OsMYB-MYC genes in different tissues and under drought and salt stress

3 討 論

水稻是中國主要的糧食作物之一，同時(shí)也是進(jìn)行植物科學(xué)研究的模式植物之一，加強(qiáng)水稻的基礎(chǔ)研究對保障國內(nèi)糧食安全以及植物科學(xué)研究至關(guān)重要。

本試驗(yàn)利用最新的水稻基因組數(shù)據(jù)庫，通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生物信息學(xué)手段，對水稻MYB-MYC基因家族進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明共有17個(gè)水稻MYB-MYC基因被鑒定。OsMYB-MYC基因定位大多都在細(xì)胞核中，部分基因也定位于葉綠體或者線粒體等部位，表明大部分的OsMYB-MYC基因都在細(xì)胞核中行使功能，部分OsMYB-MYC基因也可能在葉綠體或者線粒體中進(jìn)行表達(dá)，行使生理生化功能。

通過系統(tǒng)進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，水稻與其他植物的MYB-MYC蛋白進(jìn)化關(guān)系很近，基序motif 4和motif 6存在于所有的水稻MYB-MYC蛋白中，且同一亞組內(nèi)的基因具有相似的保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，MYB-MYC蛋白在單子葉和雙子葉植物分化之前已經(jīng)存在。順式作用元件的分析表明OsMYB-MYC基因在光響應(yīng)、激素響應(yīng)、逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮作用。GO注釋結(jié)果表明，OsMYB-MYC基因廣泛參與了細(xì)胞組成、分子功能、生物進(jìn)程3個(gè)生理過程。

MYB-MYC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域含有MYB和MYC結(jié)構(gòu)域，部分轉(zhuǎn)錄因子含有bHLH結(jié)構(gòu)域，因此MYB-MYC基因功能非常豐富。前人研究表明MYB-MYC基因參與植物生長發(fā)育、響應(yīng)植物激素以及非生物脅迫的響應(yīng)。例如，擬南芥AtMYC2基因在植物激素JA[31-33]、ABA[4]代謝途徑中起到重要作用；通過抑制分生組織的細(xì)胞分裂從而抑制擬南芥根系的伸長，同時(shí)促進(jìn)側(cè)根的形成[34]；還參與擬南芥的晝夜節(jié)律、光和光敏色素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[35]；影響種子的發(fā)育[36]；水稻OsMYC2基因參與調(diào)控水稻的衰老生理，同時(shí)參與水稻光信號介導(dǎo)[37]。MYB-MYC基因同時(shí)參與植物逆境脅迫。例如，擬南芥AtMYC2基因通過參與JA介導(dǎo)的相關(guān)途徑來抵御非生物脅迫以及生物脅迫[38]，同時(shí)在干旱脅迫下起到轉(zhuǎn)錄激活作用[4]；過表達(dá)水稻OsMYC2能夠增強(qiáng)JA相關(guān)基因的表達(dá)，從而抵御細(xì)菌的侵染[39]。本試驗(yàn)通過對水稻的表達(dá)模式分析表明，OsMYB-MYC基因在水稻的不同組織以及非生物脅迫下也有明顯的表達(dá)差異，這些結(jié)果說明OsMYB-MYC廣泛參與水稻的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)。