何 靜 ， 李國(guó)偉，海 勒 ，吉日木圖,

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古駱駝研究院，內(nèi)蒙古阿拉善右旗 737300)

在自然界，纖維素是最豐富的可再生資源，通過(guò)對(duì)纖維素資源的充分利用，可以有效緩解環(huán)境污染、全球能源短缺以及動(dòng)物飼料資源緊張等問(wèn)題。目前，自然界中對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然纖維素降解的有效途徑是生物降解，主要是借助真菌、細(xì)菌和放線菌產(chǎn)生的纖維素酶來(lái)進(jìn)行降解；其中真菌的降解能力最強(qiáng)，木霉菌[1]和曲霉菌[2]產(chǎn)生和分泌的纖維素酶系最全面，效果也最佳。相較于真菌，細(xì)菌的降解能力較低，但是細(xì)菌具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快和發(fā)酵周期短等優(yōu)勢(shì)。因此，從自然界中篩選生長(zhǎng)速度快、纖維素酶活性高、對(duì)培養(yǎng)條件和產(chǎn)酶條件要求適宜的纖維素分解細(xì)菌是一項(xiàng)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題[3-4]。

纖維素酶作為重要的酶制劑，已經(jīng)在人們生活的各個(gè)方面(畜牧業(yè)、食品、紡織、環(huán)保及化工等)得到廣泛應(yīng)用。從環(huán)境中篩選高效降解木質(zhì)纖維素的菌株則成為重中之重的研究方向。目前研究人員已針對(duì)哺乳動(dòng)物，如豬[5]、馬[6]、奶牛[7]、狗[8]和小鼠[9]等開展了不同區(qū)段胃腸道微生物多樣性的研究，以期能夠分離和鑒定出高效降低木質(zhì)纖維素的菌株。但是針對(duì)雙峰駝胃腸道微生物的研究十分有限。雙峰駝棲息于干旱的荒漠和半荒漠地區(qū)，喜食白沙蒿、鰭薊、沙蓬、梭梭、駝絨藜、白刺等植物。被譽(yù)為“沙漠之舟”的雙峰駝經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇，形成了獨(dú)特的生理功能，如解毒、耐饑渴、耐干旱、耐熱、耐寒等特性。雙峰駝的消化系統(tǒng)與其他反芻動(dòng)物不同，雙峰駝僅有瘤胃、網(wǎng)胃、皺胃3個(gè)胃，沒(méi)有瓣胃[10]。先前的研究表明，與其他草食性動(dòng)物相比較，飼料顆粒在駱駝胃內(nèi)的滯留時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)[11-12]。 近年來(lái)，駱駝腸道微生物的研究得到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。2013年，研究人員通過(guò)對(duì)單峰駝瘤胃微生物基于宏基因組焦磷酸測(cè)序，發(fā)現(xiàn)從門的水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes，占55.5%)、厚壁菌門(Firmicutes，占22.7%)和變形桿菌門(Proteobacteria，9.2%)為主導(dǎo)菌群；分析瘤胃微生物潛在功能后發(fā)現(xiàn)，碳水化合物功能是單峰駝瘤胃微生物最豐富的功能類別，并且牛和駱駝具有相似的消化系統(tǒng)，單峰駝瘤胃中微生物的代謝功能與牛的極為相似[13]。2015年，Gharechahi 等[14]通過(guò)采集3峰成年雌性單峰駝的瘤胃內(nèi)容物，基于16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序探究單峰駝瘤胃中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)駱駝瘤胃微生物在結(jié)構(gòu)上與其他反芻動(dòng)物相似，但在組成上不同。導(dǎo)致駱駝獨(dú)特瘤胃微生物組成的主要是其瘤胃中纖維素分解細(xì)菌的高度富集。2018年，Gharechahi等[15]對(duì)駱駝瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行全宏基因組測(cè)序，擬桿菌門含有較高的脫支酶和寡糖降解酶基因，厚壁菌門和纖維桿菌門含有豐富的纖維素酶和半纖維素基因，并且具有極高的多樣性。為了分離高效的駱駝源纖維素分解菌株，本研究采用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板初篩法和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩法，從雙峰駝糞便內(nèi)容物中分離篩選能夠高效降解纖維素的細(xì)菌，并通過(guò)生化指標(biāo)、16S r RNA序列測(cè)定等方法對(duì)該菌株進(jìn)行種屬鑒定，同時(shí)研究其所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)特性，為開發(fā)雙峰駝源纖維素降解菌株提供菌種來(lái)源與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市烏拉特后旗養(yǎng)殖廠，隨機(jī)采集10峰3歲成年健康雙峰駝(體質(zhì)量平均約為235 kg)的新鮮糞便，裝入 50 mL無(wú)菌無(wú)酶離心管中，放入于 4 ℃冰袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

CMC-Na培養(yǎng)基[16]：CMC-Na 5.0 g，(NH4)2SO42 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂粉 15.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

搖瓶發(fā)酵液體培養(yǎng)基[16]：普通 LB液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的 羧甲基纖維素(CMC)，用于纖維素分解菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3 方 法

1.3.1 纖維素分解菌的篩選、分離和純化 稱量1 g樣品加入100 mL的富集培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)3～4 d。取上述富集培養(yǎng)后的菌懸液稀釋10-3～10-6，再?gòu)母鱾€(gè)稀釋樣品中取100 μL液體在CMC-Na固體培養(yǎng)基平板上涂布，于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～ 3 d[17]。之后采用剛果紅染色法對(duì)菌株篩選，測(cè)量菌落直徑(測(cè)量結(jié)果用d表示)和透明圈直徑(測(cè)量結(jié)果用D表示)。根據(jù)透明圈直徑和菌落直徑的比值(D/d)大小進(jìn)行菌株產(chǎn)纖維素酶能力的初步判斷，比值越大，則產(chǎn)酶能力越強(qiáng)，根據(jù)此原則從中選取產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。挑出D/d比值大的菌落純化培養(yǎng)。純化后測(cè)定D/d比值較大菌株的纖維素酶活力，選取產(chǎn)纖維素酶活力強(qiáng)的菌株用于后續(xù)研究[18]。

1.3.2 CMCase酶活力的測(cè)定 將菌株接種到液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)3 d后離心取上清液，作為粗酶液。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，采用3,5-二硝基水楊酸(DNS) 試劑法測(cè)定纖維素酶活力，羧甲基纖維素酶(CMCase)和濾紙酶(FPase)活力以每毫升粗酶液每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為1個(gè)酶活力單位(IU/mL)[16,18]。每組試驗(yàn)做3次平行。

1.3.3 CMCase的酶學(xué)性質(zhì)研究 酶反應(yīng)最適pH測(cè)定：將粗酶液置于pH 4、5、6、7、8和9的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，50 ℃反應(yīng) 30 min，取出發(fā)酵液體測(cè)定CMCase活性，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，確定CMCase反應(yīng)的最適pH。

酶反應(yīng)最適溫度的確定：將粗酶液分別置于不同溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃)發(fā)酵30 min，取出發(fā)酵液體測(cè)定CMCase活力，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，確定CMCase反應(yīng)的最適溫度。

酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定：將所制備的粗酶液分別在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃和70 ℃水浴保溫10～60 min，取出發(fā)酵液體在最適溫度和pH下測(cè)定剩余酶活，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，評(píng)價(jià)該酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.4 菌株鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：利用光學(xué)顯微鏡，對(duì)菌株細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，取培養(yǎng) 3～5 d 的分離菌菌液進(jìn)行革蘭氏染色，確定細(xì)菌的革蘭氏屬性；并觀察菌落形狀、大小、顏色、透明度、光澤度、質(zhì)地、邊緣整齊程度、隆起度等。

生理生化鑒定：觀察菌落形態(tài)、透明度、顏色和邊緣等。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[19]中的方法測(cè)定分離菌株的生理生化特性。

分子生物學(xué)鑒定：提取分離菌株基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物[20](27F:5′-AG- AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GG-TTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增菌株的 16S rRNA 基因。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共 24個(gè)循環(huán)；72 ℃ 修復(fù)延伸 10 min；4 ℃保存。獲得的PCR產(chǎn)物送至美吉生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行同源性分析。將該序列提交至NCBI，序列號(hào)為MK396502。

1.3.5 分離菌株產(chǎn)酶條件研究 不同pH對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響：改變初始pH分別為4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，180 r/min震蕩培養(yǎng) 3～5 d后，取出液體檢測(cè)CMCase活力，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH。

不同溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響：在pH確定后，改變培養(yǎng)溫度，分別調(diào)至20 ℃、25 ℃、 30 ℃、35 ℃和40 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)3 d后，取出液體檢測(cè)CMCase活力，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適發(fā)酵溫度。

不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響：在pH和溫度確定的條件下，改變初始接種量，分別為1%、5%、10%、15%和20%，180 r/min震蕩培養(yǎng)3 d后，取出液體檢測(cè)CMCase活力，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最適接 種量。

連續(xù)發(fā)酵對(duì)菌株產(chǎn)酶活力測(cè)定：將篩選出的降纖維素菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)5 d的發(fā)酵培養(yǎng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每天取出菌液，檢測(cè)CMCase酶活力，確定菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將獲得的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析,選取同源性較高的模式菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,借助MEGA 7.0軟件分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，用Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的分離

為了能夠篩選出產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌株，經(jīng)CMC-Na平板初篩，通過(guò)剛果紅染色從駱駝糞便內(nèi)容物中篩選出能夠降解纖維素的菌株。對(duì)透明圈較大的菌株進(jìn)行純化，并檢測(cè)其纖維素酶活力(圖1)。AT9-6的CMCase酶活達(dá) (0.48±0.03)IU/mL，F(xiàn)Pase為(0.21±0.06)IU/mL，相較于其他菌株，該菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶的活力(表1)。

2.2 AT9-6菌株粗酶活性

2.2.1 酶反應(yīng)最適pH及最適溫度 pH是影響酶催化效率的條件之一，而溫度是影響酶穩(wěn)定性的重要因素。按照酶活測(cè)定方法，計(jì)算相對(duì)酶活，確定不同pH和溫度對(duì)纖維素酶活力的影響。由圖2可知，CMCase反應(yīng)最適pH為 6.0；當(dāng)pH為5.0～9.0時(shí)，該菌株的酶活力比較穩(wěn)定，在pH較高時(shí)，該酶仍保持高活力的80%左右，表明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶具有耐堿性。當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)相對(duì)酶活性最大。當(dāng)溫度在40～60 ℃時(shí)，該酶的活力大于80%；當(dāng)溫度大于70 ℃時(shí)，該酶的酶活迅速下降，表明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶具有一定的耐熱性。

圖1 菌株AT9-6在CMC-Na平板上的透明圈Fig.1 Transparent circle of strain AT9-6 on CMC-Na plate

菌株StrainD/d值D/d value羥甲基纖維素酶活力/(IU/mL)CMCase activity濾紙酶活力/(IU/mL)FPase activityAT1-71.770.36±0.020.06±0.01AT3-31.320.26±0.010.1±0.02AT5-71.460.12±0.020.07±0.01AT6-41.840.41±0.040.14±0.3AT9-62.320.48±0.030.21±0.06

2.2.2 酶熱穩(wěn)定性 在45～70 ℃對(duì)提取的粗酶液分別處理10～60 min，計(jì)算相對(duì)酶活，判斷該酶的熱穩(wěn)定性。由圖3可知，在45 ℃時(shí)，分離菌纖維素酶的活性在處理60 min時(shí)仍可達(dá)85%以上。在50 ℃時(shí)，分離菌纖維素酶的穩(wěn)定性相對(duì)較好，水浴60 min后酶活力仍可達(dá)65%以上；在 55 ℃保溫20 min，該酶相對(duì)活性仍可保留在60%以上；當(dāng)溫度達(dá)到65 ℃和70 ℃，處理 10 min時(shí)，其酶相對(duì)活力顯著下降，相對(duì)酶活力僅為40%左右。說(shuō)明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶在 45～50 ℃熱穩(wěn)定性較好。

圖2 不同pH(A)和溫度(B)下的酶活力Fig.2 Enzyme activity under different pH(A) and temperature(B)

圖3 菌株AT9-6 產(chǎn)CMCase的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of CMCase

2.3 分離菌株鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株生理生化指標(biāo) 通過(guò)對(duì)成年雙峰駝的糞便微生物進(jìn)行篩選，最終得到1 株酶活較高的菌株AT9-6。將該菌株接種在CMC-Na培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)4 d，由圖4可知，該菌株菌落為圓形淡黃色，表面光滑，邊緣整齊，革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性，菌體桿狀。由表2可知，該菌株能夠利用葡萄糖。氧化酶和接觸酶反應(yīng)為陽(yáng)性，可以利用明膠，能利用各種碳水化合物為碳源，并且能夠使硝酸鹽還原。根據(jù)菌株AT9-6的形態(tài)學(xué)特性及生理生化特性鑒定結(jié)果，初步確定該菌株屬于纖維單胞菌屬。

圖4 菌株AT9-6菌落形態(tài)及革蘭氏染色(10×100)Fig.4 Colony morphology and gram staining of the strain AT9-6

2.3.2 菌株分子生物學(xué) 測(cè)序結(jié)果顯示，該纖維素分解菌AT9-6的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 255 bp左右。序列同源性分析顯示，菌株AT9-6與纖維單胞菌屬細(xì)菌的16S rRNA序列相似性達(dá)99%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，該菌株與C.cellulansstrain親緣關(guān)系最近(圖5)。綜合該菌株的菌落形態(tài)、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定獲得的纖維素分解菌AT9-6為纖維化纖維微菌。

表2 菌株AT9-6生理生化特性Table 2 Physiological-biochemical characteristic of AT9-6

注: + : 陽(yáng)性; - : 陰性。

Note: +,Positive; -,Negative.

圖5 基于16S rRNA的纖維素分解菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic denfrogram of 16S rRNA gene sequence

2.4 菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的初步優(yōu)化

2.4.1 不同pH對(duì)菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 不同菌株發(fā)酵培養(yǎng)要求的起始pH不同；初始pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致該菌株的產(chǎn)酶能力迅速下降。適當(dāng)pH有利于菌株生長(zhǎng)和菌株產(chǎn)酶；一旦pH過(guò)低或過(guò)高會(huì)直接抑制菌株生長(zhǎng)，從而抑制酶的產(chǎn)生。本研究設(shè)置不同的起始pH，以確定pH對(duì)菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響。結(jié)果如圖6所示，隨著pH的逐漸升高，其產(chǎn)酶活性也逐漸升高。在pH 4.0時(shí)，產(chǎn)酶活力最低，僅為0.37 IU/mL；在pH 6.0～8.0，該菌的產(chǎn)酶效果較好，在pH 7.0時(shí)產(chǎn)酶效果最好，酶活力可達(dá)0.54 IU/mL。當(dāng)pH繼續(xù)增加時(shí)，該菌株的產(chǎn)酶能力逐漸下降。故最適AT9-6菌株產(chǎn)酶的最佳pH為7.0。

圖6 不同初始pH下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.6 Result of different pH on cellulase production of AT9-6

2.4.2 不同溫度對(duì)菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 培養(yǎng)溫度直接影響菌株產(chǎn)酶的活力和酶的穩(wěn)定性。由圖7可知，隨著溫度的升高，菌株產(chǎn)酶活力先增大后降低。在20 ℃，酶活力最低，酶活僅為0.24 IU/mL；在30 ℃時(shí)，菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)，酶活力可達(dá)0.62 IU/mL。說(shuō)明培養(yǎng)溫度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶存在一定的影響，較低溫度和較高溫度都不利于產(chǎn)酶。當(dāng)溫度較低時(shí)，菌株生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致酶活力偏低。溫度過(guò)高可能會(huì)造成菌株的過(guò)早老化，酶分泌量減少。因此，初步確定在30 ℃條件下，CMC酶活最大。

圖7 不同溫度下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.7 Result of different temperature on cellulase production of AT9-6

2.4.3 不同接種量對(duì)菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 在發(fā)酵過(guò)程中，適宜的接種量能夠使細(xì)菌發(fā)揮最佳的產(chǎn)酶能力。接種量的多少直接影響菌株的產(chǎn)酶能力，接種量過(guò)小會(huì)使細(xì)菌延遲進(jìn)入對(duì)數(shù)期，使產(chǎn)酶的時(shí)間推遲；接種量過(guò)大會(huì)使細(xì)菌提前進(jìn)入對(duì)數(shù)期，使產(chǎn)酶時(shí)間過(guò)早。如圖8所示，菌液的接種量會(huì)明顯影響酶活力。當(dāng)接種量為10%時(shí)，CMC酶活力最高為0.66 IU/mL；當(dāng)接種量增加到20%時(shí)，酶活顯著下降，達(dá)到最低 0.36 IU/mL。故最適AT9-6菌株產(chǎn)酶的最佳接種量為10%。

圖8 不同接種量下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.8 Result of different inoculum volume on cellulase production of AT9-6

2.4.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株AT9-6產(chǎn)CMCase的影響 在上述最佳的發(fā)酵條件下，對(duì)菌株AT9-6進(jìn)行連續(xù)5 d的發(fā)酵產(chǎn)酶，每隔24 h取樣1次，測(cè)定CMCase活性。由圖9可知，該菌株在發(fā)酵24～72 h酶活性呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在發(fā)酵培養(yǎng) 72 h時(shí)，產(chǎn)酶活性達(dá)到最強(qiáng)，可達(dá)0.66 IU/mL。隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，活力逐漸降低。分析原因可能是在72 h時(shí)該菌株適應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基后開始大量產(chǎn)纖維素酶；在96 h后，受培養(yǎng)基成分和菌株老化的影響，菌株產(chǎn)酶能力下降，酶活力僅有0.46 IU/mL。故最適AT9-6菌株產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為72 h。

圖9 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間下AT9-6產(chǎn)酶的結(jié)果Fig.9 Result of different fermentation time on cellulase production of AT9-6

3 討論與結(jié)論

纖維素作為自然界中廣泛存在、含量最多的一種多糖，是微生物重要的碳源之一。纖維素是植物重要的組成部分，幾乎占總干質(zhì)量的50%[21]，通過(guò)對(duì)纖維素資源的充分利用，可以有效緩解污染、全球能源短缺等問(wèn)題。但是，目前絕大部分的纖維素都不能被有效利用。據(jù)報(bào)道，有效分解纖維素不僅可以使自然界的纖維素資源轉(zhuǎn)化為所需要的能源，更能減少動(dòng)物飼料中的粗纖維含量，促進(jìn)動(dòng)物的消化吸收[22]。目前降解纖維素的主要方法有微生物降解、化學(xué)降解、物理降解等[23]。大量的研究證實(shí)，生物降解纖維素是一種有效降解纖維的手段，該方法主要是利用纖維素分解菌及其所產(chǎn)生的酶來(lái)降解纖維素[24]。目前該方法被廣泛應(yīng)用于不同草食性動(dòng)物胃腸道內(nèi)容物的篩選中，如大熊貓[25]、藏豬[26]、牛[27]等。駱駝具有獨(dú)特的微生物特性，Gharechahi等[15]對(duì)駱駝瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行全宏基因組測(cè)序，確定了有助于木質(zhì)纖維素降解和發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸的關(guān)鍵物種。但是從雙峰駝胃腸道中分離分解纖維素細(xì)菌的研究仍然鮮見。本研究以駱駝糞便為研究對(duì)象，分離篩選具有高效降解纖維的細(xì)菌。

研究證實(shí)，以CMC為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，基于剛果紅染色法初步分離篩選纖維素分解菌，簡(jiǎn)單快捷、成本低，被認(rèn)為是篩選纖維素分解菌最有效方法之一[28]。目前，已有許多研究人員從動(dòng)物的胃腸道、糞便、土壤中分離出能夠降解纖維素的細(xì)菌，如芽孢桿菌屬[26]、瘤胃球菌屬[29]、擬桿菌屬[30]、假單胞桿屬[31]、梭菌屬[32]等。為了篩選駱駝源的纖維素分解菌株，本試驗(yàn)采用 CMC-Na 平板初篩法和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩法，從雙峰駝糞便內(nèi)容物中分離篩選能夠高效降解纖維素的細(xì)菌，并對(duì)其中1株透明圈較大的菌株進(jìn)行純化后檢測(cè)其纖維素酶活力和菌株鑒定，初步鑒定該菌株為纖維化纖維微菌的一種，屬纖維單胞菌屬，放線菌門。

纖維單胞菌屬由纖維化纖維微細(xì)菌(C.cellulans),芬氏纖維微菌(C.funkei和C.terreum)3 個(gè)種組成。這些物種屬于需氧放線菌，表現(xiàn)為多形性革蘭氏陽(yáng)性桿菌，自然存在于土壤、水和腐爛的木材中，也有部分菌株來(lái)自于海洋、昆蟲體表和人類腸道中[33]。此次篩選的菌株C.cellulans，屬纖維單胞菌屬，纖維單胞菌屬作為豐富糖苷酶的來(lái)源被人們廣泛關(guān)注。纖維微菌屬蘊(yùn)含許多糖苷酶，如內(nèi)-β-1,4-葡聚糖酶、內(nèi)-β-1,4-木聚糖酶、內(nèi)-β-1,4-甘露聚糖酶和內(nèi)-β-1,3-葡聚糖酶。2012年，研究人員從云南紅豆杉的根土中分離出能分泌7-木糖紫杉烷糖基水解酶C.cellulansstrain F16[34]。能夠分泌纖維素酶的C.cellulans已從各種不同的環(huán)境中被分離篩選出來(lái)。此外，Wei等[35]研究報(bào)道，C.cellulansL804為一種木質(zhì)纖維素降解菌，可將未經(jīng)處理的玉米秸稈轉(zhuǎn)化為微生物絮凝劑，該菌株分泌纖維素分解酶活性的最佳pH為5.2～6.0。但從動(dòng)物胃腸道中分離獲得C.cellulans的報(bào)道相對(duì)較少。本次研究獲得的菌株C.cellulans可以分泌纖維素酶，它在雙峰駝源纖維素降解菌株上具有一定的應(yīng)用 潛力。

在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中，菌體的培養(yǎng)條件對(duì)其生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累都有重要影響。菌株的發(fā)酵條件，如碳源、氮源、溫度、pH和接種量等諸多因素對(duì)纖維素酶的產(chǎn)生具有顯著的影響。對(duì)于好氧性微生物，菌株的接種量會(huì)影響發(fā)酵培養(yǎng)基的溶氧量，溶氧量不足直接會(huì)影響菌株的繁殖和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[36]。此外，溫度、pH和發(fā)酵時(shí)間都會(huì)影響菌株產(chǎn)纖維素酶的活力。據(jù)報(bào)道，真菌纖維素酶一般為酸性酶，在pH 4～5、溫度40 ℃～60 ℃活性較高。細(xì)菌纖維素酶的最適pH通常在中性或偏堿性，其最適溫度為40 ℃～70 ℃。本次研究的纖維素酶最適溫度為40 ℃，最適pH為6，該結(jié)果與栗叢瑞[37]的研究結(jié)果相似。此外，研究證實(shí)纖維單胞菌最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃～ 37 ℃，最適pH為6.0～8.0[38]，本研究結(jié)果與報(bào)道一致?？傊狙芯亢Y選并鑒定出一株纖維化纖維微菌，它具有相對(duì)較高的纖維素酶活。該菌株所產(chǎn)生的酶具有一定的耐堿性和耐熱性，因此可將該酶應(yīng)用于食品行業(yè)或廢料處理等方面。

綜上所述，本研究從雙峰駝糞便樣本中分離到1 株纖維素分解菌。根據(jù)該菌的菌落形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌為C.cellulans。該菌株產(chǎn)纖維素酶的最適溫度為 40 ℃～50 ℃，最適pH為6.0。該菌株所產(chǎn)生的酶具有一定的耐堿性和耐熱性。初步確定該菌株液體發(fā)酵的最佳接種量為10%，最適初始pH為 7.0，最適培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適發(fā)酵時(shí)間為 72 h。