郝佳夢 周慶瑩 陳章風 李予煊 閆曉博 郭軍鵬 劉宏巖

(1河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050017；2長春中醫(yī)藥大學)

疲勞是機體復雜的生理變化過程，其發(fā)生機制目前尚沒有統(tǒng)一的定論〔1，2〕。氧自由基-脂質(zhì)過氧化學說認為：運動等應激過程可產(chǎn)生大量氧自由基，中等至高濃度的自由基堆積可導致細胞線粒體膜脂質(zhì)過氧化并產(chǎn)生氧化應激反應，從而促使細胞凋亡甚至壞死〔3，4〕，導致疲勞無法緩解，同時還可加速機體衰老過程〔5〕。因此，清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化是抗疲勞且防止疾病發(fā)生的途徑之一?！督饏T要略·血痹虛勞病》篇中“虛勞病”和現(xiàn)代醫(yī)學的“疲勞”概念有相似之處，小建中湯為其中治療勞力過度所致虛勞里急的代表方劑。該方調(diào)和陰陽，和里緩急，能夠治療陰液耗損過多所導致的虛勞里急證候，臨床治療疲勞病癥效果顯著〔6〕。本實驗探討小建中湯抗小鼠運動性疲勞功效及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性昆明小鼠60只，體重(20±2)g，由長春市易思實驗動物技術有限責任公司提供，許可證號：SCXK(吉)2016-0003，適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2藥物與試劑 小建中湯：桂枝、白芍、炙甘草、生姜、大棗、飴糖。按人∶小鼠=1∶10換算小鼠用藥量。上方定為中劑量組，將劑量的三分之一和三倍作為低劑量和高劑量組，各組給藥量分別為0.58、1.75、5.25 mg/kg。煎煮時將除飴糖外藥材以8倍體積水浸泡0.5 h，文火0.5 h，后納膠飴，取液備用；二煎以6倍體積水，兩次煎液合并后濃縮。四君子湯：人參、白術、茯苓、甘草，煎煮方法同上。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(20170720G)、超氧化物歧化酶(SOD)(20170612)、丙二醛(MDA)(20170610)試劑盒購自北京華英生物工程研究所；一抗GAPDH、Keap1、轉錄因子-E2相關因子(Nrf)2、二抗辣根過氧化物酶(HRP)購于Proteintech公司。

1.3儀器 M200PRO型酶標儀(TECAN公司中國)，Omega Lum G型化學發(fā)光凝膠成像儀(Aplegen公司)。

1.4負重游泳篩選 小鼠負重游泳，選取出現(xiàn)力竭狀態(tài)時間相近的48只小鼠。力竭標準：小鼠在水中旋轉，動作的協(xié)調(diào)性顯著降低，身體不能維持在水平面反復浮沉，至再次浮出水面的時間超10 s，被提起后無反抗掙扎。

1.5分組及給藥 將小鼠隨機分為正常組(C)、模型(M)組、小建中湯低劑量(SL)組、小建中湯中劑量(SM)組、小建中湯高劑量(SH)組、四君子湯(JZ)組，每組8只。C和M組按200 mg/(kg·d)給予生理鹽水，中藥各組按相應比例灌服小建中湯和四君子湯，給藥1 h后力竭游泳訓練，連續(xù)10 d。

1.6樣本采集及檢測 記錄每次力竭游泳時間。第10天游泳后，取雙側股四頭肌凍存?zhèn)溆?。取骨骼?00 mg，研磨，3 500 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測GSH-Px、SOD、MDA含量。

1.7Western印跡實驗方法 取肌肉組織50 mg，加入1 ml放射免疫沉淀(RIPA)裂解液研磨組織，冰上裂解30 min，隨后4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清備用。配置凝膠，進行垂直電泳，轉膜120 min。放入5%脫脂奶粉封閉60 min，加入一抗，4℃過夜，二抗孵育60 min。采用電化學發(fā)光(ECL)法進行蛋白顯色，用Gelpro32軟件對顯色條帶灰度值進行定量分析，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度比值作為統(tǒng)計結果。

1.8統(tǒng)計方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組游泳時間 與M組〔(150±7.09)s〕相比，SL、SM、SH、JZ組均可顯著延長小鼠力竭游泳時間〔(217±11.90)、(193±13.12)、(217±17.77)、(184.27±15.24)s，P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.05〕。

2.2各組股四頭肌GSH-Px、SOD、MDA水平 與C組比較，M組GSH-Px、SOD含量顯著下降(P<0.01，P<0.05)，MDA含量顯著增多(P<0.05)。與M組相比，GSH-PX、SOD含量以SL、SH組、JZ組變化顯著(P<0.01)；MDA含量以SL、SM、SH組變化顯著(P<0.01，P<0.01,P<0.05)，JZ組未見顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組GSH-Px、SOD、MDA水平

與C組相比，1)P<0.05，2)P<0.01；與M組相比，3)P<0.05，4)P<0.01

2.3各組股四頭肌Keap1和Nrf2蛋白表達 與C組(1.00±0.03)相比，M組Keap1蛋白表達(1.12±0.02)顯著上升(P<0.05)。與M組相比，SL、SH和JZ組Keap1蛋白(0.97±0.04、1.04±0.03、0.61±0.03)顯著降低(P<0.05)，SM組為(1.11±0.03)，無顯著差異(P>0.05)。在Nrf2蛋白表達方面， M組(0.38±0.06)較C組(1.18±0.08)明顯下降(P<0.01)；與M組相比，SL、SM、SH組Nrf2蛋白表達量(1.00±0.01、0.68±0.02、0.77±0.03)均明顯提高(均P<0.05)，JZ組(0.40±0.06)無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組股四頭肌Keap1和Nrf2表達

3 討 論

疲勞屬于中醫(yī)的虛勞病?！督饏T要略》中的虛勞病篇以桂枝湯加減的湯劑——小建中湯、黃芪建中湯、桂枝加龍骨牡蠣湯作為抗疲勞的方劑。虛勞病的病因為勞傷過度〔7〕，繼而耗傷人體的氣血陰陽，結果導致陰陽失和、氣血失常而疲勞。因此認為，虛勞病的病機乃是陰陽失和、氣急逆亂，并非臟腑虧虛、陰陽不足〔8〕。基于此，仲景治療虛勞是采用調(diào)和營衛(wèi)的方法，通過調(diào)和營衛(wèi)來調(diào)和逆亂的氣血陰陽。小建中湯為虛勞病中治療勞力過度所致虛勞里急的代表方劑，湯證所列癥狀包括“悸，衄，腹中痛，夢失精，四肢痠疼，手足煩熱，咽干口燥”，與急性勞傷所致的疲勞狀態(tài)較為相似，基本病機是由于急性勞傷而汗液大出，造成衛(wèi)陽之氣被郁、營陰津液不斂，從而形成機體陰陽失和、氣機逆亂的證候。該方桂枝、白芍相配，一辛一酸、一陰一陽、一散一斂，使衛(wèi)氣宣發(fā)、營陰內(nèi)斂，芍藥加倍更增酸甘化陰、緩急止痛之功；生姜兼能發(fā)散，大棗補脾和胃；甘草、桂枝相合辛甘化陽以通衛(wèi)，甘草、白芍相合酸甘化陰以和營；飴糖滋養(yǎng)陰液，以助汗源，諸藥合力平調(diào)陰陽，調(diào)和氣血。氣血和則生機有源，對于陰陽失調(diào)、氣血失和導致的虛勞里急病癥具有確切療效。

一些學者認為疲勞是“氣虛”證，所謂“少氣不足以息則倦怠無力”，并且“勞則氣耗，勞則喘息汗出”勞倦過度可以導致氣耗而虛，因而治療時常采用補氣健脾方來補虛抗勞。四君子湯作為補氣經(jīng)典方劑，在研究中顯示其能夠減少力竭小鼠運動后血清乳酸含量、提升肝糖原、肌糖原含量，改善免疫器官臟器指數(shù)〔9，10〕，具有提高機體運動能力的作用。

目前對于Keap1-Nrf2-ARE信號通路的研究十分廣泛〔11，12〕。生理狀態(tài)下，Nrf2主要與Keap1結合，經(jīng)泛素化作用分解，以保持在生理狀態(tài)下的低轉錄活性〔13〕。當細胞受到氧自由基(ROS)或其他親核基團刺激后，Nrf2與 Keap1解耦聯(lián)，活化的 Nrf2轉運進入細胞核，與抗氧化反應元件(ARE)相結合，下游Ⅱ相代謝酶和抗氧化酶SOD、GST-Px等的表達被激活，調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化平衡，有效清除自由基和其他氧化代謝產(chǎn)物〔14，15〕，發(fā)揮抗氧化損傷作用〔16〕，保護機體組織細胞的正常功能。研究表明，急性運動后Nrf2基因敲除小鼠的抗氧化蛋白酶含量明顯低于正常組〔17〕；一次大強度力竭運動可提高小鼠Nrf2基因轉錄〔14〕。

本實驗表明機體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，且抗氧化能力明顯不足；氧化應激狀態(tài)下Keap1與Nrf2解離，Nrf2核轉位參與抗氧化功能。長時間力竭運動后機體疲勞未恢復，抗氧化能力下降，導致Nrf2表達量下降，Nrf2不能更好地啟動下游抗氧化酶GSH-Px、SOD的生成，機體抗氧化能力不足，無法有效清除氧化代謝產(chǎn)物，疲勞狀態(tài)持續(xù)存在。本文結果提示小建中湯可以通過提高Nrf2表達，增強下游抗氧化蛋白酶GSH-Px、SOD的活性，逆轉力竭大鼠氧化應激損傷。由此可見，小建中湯通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2-ARE信號傳導通路提高GSH-Px、SOD抗氧水平而發(fā)揮抗疲勞的作用。