王春喜 張納新 高亮 王雪

(天津市第三中心醫(yī)院呼吸科 天津市肝膽疾病研究所 天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，天津 300170)

臨床上細(xì)菌性肺炎也較為普遍，占成人各類病原體肺炎的80%〔1〕。細(xì)菌性肺炎因宿主年齡、伴隨疾病、免疫狀態(tài)，臨床表現(xiàn)也有較大差異。細(xì)菌性肺炎臨床癥狀多樣且無(wú)典型性，臨床多表現(xiàn)為呼吸困難、體溫不升等特點(diǎn)，病情發(fā)展較為迅速〔2〕。老年人與幼兒免疫功能較弱，機(jī)體抵抗力與防御機(jī)制差，更易受到疾病侵襲。2008年世界衛(wèi)生組織發(fā)布全球兒童死亡原因報(bào)告，全球約有880萬(wàn)名5歲以下兒童死亡，其中約47.6萬(wàn)例死于肺炎鏈球菌感染，在常見病因中排首位〔3〕。作為大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，阿奇霉素在臨床上應(yīng)用廣泛〔4〕。近年來(lái)，由于臨床上濫用抗菌藥,導(dǎo)致耐藥菌株增加,部分患者應(yīng)用抗菌藥治療效果不佳。目前雖對(duì)肺炎發(fā)病機(jī)制的研究較多，也有相關(guān)參與肺炎發(fā)病的生化指標(biāo)已被應(yīng)用于肺炎的臨床診斷和治療中〔5,6〕，但肺炎的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論，國(guó)內(nèi)外關(guān)于藥物對(duì)細(xì)菌性肺炎免疫功能的研究仍較少。本研究擬探索莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素對(duì)細(xì)菌性肺炎老齡大鼠免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料 48只SPF級(jí)Wistar雄性老年大鼠(18月齡)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重(450±50)g。飼養(yǎng)條件：室溫(23±2)℃，相對(duì)濕度60%,光照周期12 h光照/12 h黑暗的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)前給予自由進(jìn)食、飲水。

1.2主要儀器與試劑 超聲霧化器購(gòu)自江蘇魚躍醫(yī)療器械有限公司，全自動(dòng)血液分析儀(Model XT-2000i)購(gòu)自日本Sysmex公司，組織切片機(jī)(Model RM2315)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司(北京，中國(guó))，LH50A型倒置相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司(東京，日本)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自PerkinElmer公司(加州，美國(guó))，單克隆抗體NF-κB p65抗體及二抗均購(gòu)自Santa Cruz公司(紐約，美國(guó))，莫西沙星片購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司(批號(hào)BJ13520)，阿奇霉素購(gòu)自上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司(批號(hào)H20000477)。

1.3試驗(yàn)菌株懸浮液的制備 取出菌株凍存管，對(duì)肺炎鏈球菌菌株(上海寶米科生物科技有限公司)進(jìn)行活化。將活化的肺炎鏈球菌菌株接種于血瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h進(jìn)行培養(yǎng)。取第3代菌株用無(wú)菌生理鹽水稀釋成含細(xì)菌濃度為108CFU/ml濃濃的混懸液備用。

1.4動(dòng)物模型建立及分組 經(jīng)鼻吸入法〔7〕構(gòu)建肺炎模型。試驗(yàn)組動(dòng)物麻醉后，置一個(gè)有2個(gè)開口的塑料容器中，將108CFU/ml濃度的菌液置于超聲霧化器中，以2 ml/min的霧化速度開啟霧化器，霧化器接入塑料容器其中1個(gè)入口，從另外一端的出口排出，霧化30 min，連續(xù)3 d。操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將48只Wistar老年大鼠分成正常對(duì)照組、模型組、莫西沙星組、莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素(聯(lián)合)組各12只。除正常對(duì)照組外，其余各組均經(jīng)鼻吸入法構(gòu)建肺炎大鼠。在此基礎(chǔ)上，莫西沙星組模擬成人常用劑量400 mg/d，大鼠按體表面積折算給藥劑量為42 mg/kg〔8〕稀釋至1 ml溶液進(jìn)行腹腔注射給藥，5 s內(nèi)注入完畢，連續(xù)7 d。聯(lián)合組給予同劑量的莫西沙星溶液及阿奇霉素(10 mg/kg 體重，濃度10 mg/ml)，連續(xù)7 d。正常對(duì)照組和模型組給予同劑量生理鹽水。

1.5標(biāo)本采集 模型建立1 d后，各組禁食水8 h后腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg體重)麻醉固定于手術(shù)臺(tái)上。胸腹部皮膚消毒，劍突下腹正中切口打開腹腔，暴露腹主靜脈，采集靜脈血，用于生化分析。開胸取肺組織，0.9%無(wú)菌生理鹽水沖洗血跡后，左肺葉放于裝有4%多聚甲醛的瓶中固定，保存于4℃冰箱，用于組織切片病理分析和免疫組化檢測(cè)。

1.6生化指標(biāo)檢測(cè) 利用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)，單位以×109/L表示；中性粒細(xì)胞比率，單位以百分比(%)表示。采用ELISA測(cè)定血清免疫球蛋白(Ig)A、IgG、血清細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-8水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.7肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色 取各組肺組織，均經(jīng)甲醛溶液和石蠟包埋，制備3 μm厚切片，恒溫箱60℃內(nèi)烤片4 h后進(jìn)行經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水(無(wú)水乙醇，95%、80%、70%、50%乙醇)。將切片放入蘇木素染料中染色5～10 min，用蒸餾水洗掉切片肺組織表面的蘇木素染料，用1%的鹽酸-酒精分色3～5 s，使細(xì)胞核染成更清晰的深藍(lán)色，自來(lái)水沖洗后，1%伊紅染料復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水透明，中性樹脂封片。

1.8免疫組化 取各組肺組織，均經(jīng)甲醛溶液和石蠟包埋，制備3 μm厚切片，恒溫箱60℃內(nèi)烤片4 h，4℃冰箱留存，行免疫組織化學(xué)染色。H2O2-甲醇液中15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2 min×3 次，加封閉液孵育10 min。倒掉液體加核細(xì)胞因子(NF)-κB p65單克隆抗體(1∶500)，4℃過(guò)夜。PBS 洗 2 min×3 次，加抗小鼠生物素化二抗孵育10 min，PBS洗2 min×3次。加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈親和素孵育10 min，PBS洗 2 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、水洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。高倍鏡下，利用Image-Pro Plus6.0 圖像分析系統(tǒng)，分析每張切片10個(gè)視野下黃色陽(yáng)性顆粒的平均光密度值為測(cè)量結(jié)果。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織病理學(xué)變化 正常對(duì)照組無(wú)論是肺泡、肺泡囊還是肺泡管結(jié)構(gòu)均清晰完整，肺泡隔菲薄，肺泡大小均勻。肺泡上皮細(xì)胞排列緊密，肺泡腔和管腔內(nèi)部未見有炎性浸潤(rùn)。終末和呼吸性細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰，可見完整的環(huán)形平滑肌。模型組肺泡、肺泡囊、肺泡管、終末和呼吸性細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)肺泡融合、肺泡隔增寬，肺泡腔內(nèi)有血管擴(kuò)張充血，甚則出血。肺泡上皮細(xì)胞排列素亂，部分可見有細(xì)胞脫落。肺間質(zhì)增生、肺泡腔和管腔內(nèi)見有大量炎性的浸潤(rùn)。與模型組相比，莫西沙星組和聯(lián)合組肺組織病理均有大幅度所改善。莫西沙星組肺泡、肺泡管和肺泡囊結(jié)構(gòu)均較清晰，終末和呼吸性細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)清晰可見完整的環(huán)形平滑肌。肺間質(zhì)増生減輕、肺泡腔和管腔內(nèi)仍見有少量的炎性浸潤(rùn)。肺泡腔內(nèi)部雖仍有血管充血，肺泡隔較薄、肺泡上皮細(xì)胞排列整齊。聯(lián)合組肺泡、肺泡囊、肺泡管、終末細(xì)支氣管、呼吸性細(xì)支氣管的結(jié)構(gòu)均完整清晰。肺泡隔菲薄，雖有少量的炎性浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)有少量血管充血，但肺泡上皮細(xì)胞排列整齊，肺泡大小均勻。見圖1。

2.2各組肺組織病理NF-κB p65免疫組化分析 各組NF-κB p65蛋白水平差異顯著(P<0.05)。與正常對(duì)照組(16.54±1.07)比較，模型組(26.83±2.35)、莫西沙星組NF-κB p65蛋白水平(19.83±1.95)顯著升高(P<0.05)。相對(duì)于莫西沙星組，聯(lián)合組NF-κB p65蛋白水平(17.21±1.68)明顯降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 各組肺組織病理組織學(xué)改變(HE 染色，×100)

圖2 各組肺組織病理NF-κB p65免疫組化(×200)

2.3各組外周血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比較 模型組白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯較正常對(duì)照組顯著增多(P<0.01)，而莫西沙星組和聯(lián)合組較模型組明顯降低(P<0.01)。相對(duì)于莫西沙星組，聯(lián)合組白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組外周血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比較

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.01；與莫西沙星組比較:4)P<0.05，5)P<0.01

2.4各組外周血清免疫球蛋白及T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)比 模型組IgA和IgG水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)；單藥莫西沙星的應(yīng)用可顯著抑制IgA和IgG的分泌(P<0.01)，但效果較莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素明顯差(P<0.01)。與正常對(duì)照組比較，模型組明顯抑制了CD3+和CD4+的產(chǎn)生和CD4+/CD8+，卻促進(jìn)了CD8+的分泌(均P<0.01)。與模型組比較，藥物干預(yù)組明顯降低了CD8+水平(P<0.01)，促進(jìn)了CD3+和CD4+水平和CD4+/CD8+(P<0.05,P<0.01)，聯(lián)合組較莫西沙星組更顯著(P<0.05)。見表2。

2.5各組外周血清Th1/Th2免疫因子比較 與正常對(duì)照組比較，模型組Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平明顯降低(P<0.01)，TNF-α和IL-2水平卻明顯升高(P<0.01)；Th2型細(xì)胞因子IL-6明顯降低(P<0.01)，IL-4和IL-8水平卻明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，莫西沙星組和聯(lián)合組IFN-γ、IL-6水平顯著升高(P<0.01)，TNF-α、IL-2、IL-4和IL-8水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。相對(duì)于莫西沙星組，聯(lián)合組IFN-γ、IL-6升高更加明顯(P<0.05)，TNF-α、IL-4和IL-8顯著降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組外周血清免疫球蛋白及T淋巴細(xì)胞亞群比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01；與莫西沙星組比較：5)P<0.01；下表同

表3 各組外周血清細(xì)胞因子比較

3 討 論

老年人細(xì)菌性肺炎是老年人感染性疾病死亡的主要原因〔9〕。研究表明，肺炎的發(fā)生與直接侵入、細(xì)胞損傷及免疫功能紊亂等機(jī)制密切相關(guān)〔10,11〕。免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng)，具有識(shí)別和排除抗原性異物、與機(jī)體其他系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)、共同維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生理平衡的功能〔12〕。機(jī)體處于炎性反應(yīng)或感染期間，免疫因子會(huì)表現(xiàn)出異常高或低水平〔13〕。鑒于老年人免疫防御功能減退、呼吸系統(tǒng)的退行性改變且常合并多種基礎(chǔ)疾病，更易受到疾病的侵襲，因此做好老年人的疾病防御工作更為必要。研究表明，相對(duì)于其他方法，經(jīng)鼻吸入法構(gòu)建細(xì)菌性肺炎模型操作較簡(jiǎn)易、可大批量同時(shí)操作，可靠性、適用性、可控性、重復(fù)性高，傷口感染、出血等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)小，更符合真實(shí)的感染途徑〔14,15〕。

作為喹諾酮類藥，目前阿莫西林臨床上主要用于治療成人上呼吸道和下呼吸道感染疾病，如社區(qū)獲得性肺炎、皮膚和軟組織感染等〔16〕。2016年中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診治指南推薦莫西沙星等呼吸喹諾酮類藥物作為初始經(jīng)驗(yàn)性抗感染藥物〔17〕。研究表明，莫西沙星能夠取得較好的療效，縮短患者穩(wěn)定的時(shí)間，聯(lián)合其他藥物治療也能取得較好的療效〔18,19〕。研究表明，42 mg/kg灌胃給藥4～6 w，莫西沙星在肺炎大鼠肺組織的穿透率高，血液及肺組織內(nèi)的游離藥物濃度較高，遠(yuǎn)超過(guò)了最低抑菌濃度和防耐藥突變濃度，可以有效清除肺炎鏈球菌，獲得較好療效〔20〕。作為一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，阿奇霉素抗菌譜廣、半衰期較長(zhǎng)、抗菌活性強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)、不良反應(yīng)較少，在炎癥部位的組織和細(xì)胞內(nèi)濃度較高，廣泛應(yīng)用于感染性疾病的治療〔4〕。研究表明阿奇霉素序貫聯(lián)合痰熱清注射液可改善機(jī)體免疫力，降低炎性程度〔21〕。臨床上，常常將白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等作為上呼吸道感染或肺炎的臨床診斷指標(biāo)。降鈣素原、C-反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值，均可作為急性上呼吸道感染的炎癥標(biāo)記物，用于鑒別和輔助診斷細(xì)菌性感染〔22〕。本結(jié)果提示莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素治療肺炎大鼠效果可能要好于單藥莫西沙星。

Ig是一組具有抗體活性的球蛋白，廣泛存在于血液、分泌液及部分細(xì)胞表面，參與機(jī)體免疫防御機(jī)制〔23〕。IgA廣泛分布于呼吸道和消化道，IgG是血清Ig的主要成分,具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗毒素作用，是機(jī)體黏膜局部抗感染免疫的主要抗體〔24,25〕。而T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定是檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，對(duì)診斷各種免疫疾病，分析發(fā)病機(jī)制具有重要意義〔26〕。本文結(jié)果提示莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素可明顯提高細(xì)菌性肺炎老齡大鼠的免疫應(yīng)答能力。

Th1和Th2平衡在維持細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)平衡中起關(guān)鍵作用，其動(dòng)態(tài)變化可反映應(yīng)疾病的不同狀態(tài)。研究表明，TNF-α水平增高可進(jìn)一步增加免疫細(xì)胞IL-8的表達(dá)，IL-8又可促進(jìn)白細(xì)胞黏附聚集在肺部組織，進(jìn)而導(dǎo)致肺泡氣體交換障礙〔27〕。IL-4 增高促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌IgE，而IFN-γ卻在一定程度抑制IgE合成〔28〕。IL-8可由TNF-α介導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生，也可通過(guò)激活NF-κB和鈣依賴性途徑分泌而來(lái)〔29〕。本研究結(jié)果表明莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素為炎性介質(zhì)刺激了大鼠外周血炎癥因子的分泌，介導(dǎo)了IFN-γ/IL-4為代表的Th1/TH2免疫平衡。莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素更能有效降低細(xì)菌性肺炎全身炎癥程度，改善細(xì)菌性肺炎大鼠的免疫功能。進(jìn)一步表明，莫西沙星和聯(lián)合阿奇霉素組均能有效改善肺組織病理?yè)p傷，莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素效果較單藥莫西沙星稍好一些。NF-κB p65作為NF-κB信號(hào)通路蛋白重要的因子，與多種細(xì)胞因子的分泌密切相關(guān)，在肺損傷發(fā)揮重要作用〔30〕。本研究NF-κB p65免疫組化結(jié)果與HE染色結(jié)果相一致，莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素作用效果更加明顯。

總之，本研究成功構(gòu)建了細(xì)菌性肺炎大鼠模型，為探索細(xì)菌性肺炎的發(fā)病機(jī)制與老年群體的治療方案提供一定的了技術(shù)支持。莫西沙星聯(lián)合阿奇霉素可有效調(diào)節(jié)Ig、T淋巴細(xì)胞亞群水平、Th1/Th2失衡，降低機(jī)體全身炎癥程度，改善細(xì)菌性肺炎引起的免疫功能紊亂，作用效果較單用莫西沙星更佳。