姚俊修，李善文，任 飛，李慶華，劉學(xué)良，吳德軍，燕麗萍

(1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 泰安 271018)

簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）是一類由1～6 個(gè)堿基組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列，在真核、原核生物基因組中分布廣泛[1-2]。根據(jù)SSR 來源可分為EST-SSR 和基因組SSR[3]，傳統(tǒng)的利用基因組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR 標(biāo)記具有成本高、試驗(yàn)步驟繁瑣、位點(diǎn)較少等缺點(diǎn)[4]，近年來，隨著測序成本降低，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為研究分子生物學(xué)相關(guān)內(nèi)容的短平快思路之一，不同植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相繼被開發(fā)利用，基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)不同植物SSR 標(biāo)記的研究也越來越多[5-7]。

接骨木屬SambucusLinn系忍冬科Caprifoliaceae 植物，為落葉喬木或灌木，本屬約20 種，遍布于溫帶和亞熱帶地區(qū)[8-9]。我國約6 種，南北均產(chǎn)。接骨木是珍貴的藥用植物，不少種類果實(shí)含油量高（35%～44%）[10]，是農(nóng)業(yè)部公布的木本油料植物之一。我國接骨木資源十分豐富，其具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，抗寒、抗旱、抗病能力強(qiáng)[11]，而對接骨木屬樹種的開發(fā)利用，我國仍處于起步階段，大多處于自然狀態(tài)且人為破壞嚴(yán)重，僅在藥用及種質(zhì)資源概述較多，其它高值化利用等研究較少[12-13]，也未見基于轉(zhuǎn)錄組測序的標(biāo)記開發(fā)及分子標(biāo)記輔助育種等相關(guān)報(bào)道，本研究基于前期對西洋接骨木果實(shí)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序獲得的數(shù)據(jù)，開發(fā)大量微衛(wèi)星標(biāo)記，為利用SSR 標(biāo)記進(jìn)行接骨木種質(zhì)資源遺傳多樣性、連鎖圖譜構(gòu)建及功能基因挖掘奠定基礎(chǔ)[14-16]。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于本課題組2016年對一株成年西洋接骨木（1987年由美國引進(jìn)，樹齡31 a，現(xiàn)定植于山東省濟(jì)南泉城公園）果實(shí)進(jìn)行Illumina HiSeq 2000 高通量測序的結(jié)果。測序時(shí)采取3 個(gè)發(fā)育時(shí)期（青果、中熟、晚熟）的果實(shí)，每階段取樣3 次重復(fù)，分別提取RNA 后委托北京諾禾致源基因公司進(jìn)行RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測序，并通過De Novo 方法組裝獲得[17]，組裝結(jié)果作為原始數(shù)據(jù)后續(xù)使用。

1.2 轉(zhuǎn)錄組SSR 位點(diǎn)鑒別

西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用Trinity 軟件進(jìn)行拼接，拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列信息以FASTA 格式儲(chǔ)存，拼接主要參數(shù)為SS_lib_type，min_kmer_cov，min_glue。通過拼接得到Unigenes 庫，并對混合的Unigenes 庫利用MISA 程序進(jìn)行SSR 位點(diǎn)搜索[18]，搜索標(biāo)準(zhǔn)為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為6、5、5、5 和5 次。

1.3 引物設(shè)計(jì)原則

采用Primer 3.0 引物設(shè)計(jì)程序（2.3.5 版，默認(rèn)參數(shù)）對含有SSR 位點(diǎn)的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，且SSR 位點(diǎn)側(cè)翼序列長度≥50 bp。引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)：1）退火溫度（Tm）在55～75 ℃之間，上、下游引物的Tm 值相差5 ℃；2）PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100～300 bp 之間，引物長度在15～30 bp之間；3）GC 含量在40%～60%之間，且上、下游引物之間無引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。對設(shè)計(jì)的SSR 引物在Unigenes 庫中進(jìn)行SSR 引物的blast 驗(yàn)證[18-19]。

1.4 試驗(yàn)材料及DNA 提取

選取8 株接骨木的成熟葉片（加拿大接骨木Sambucus canadensis3 株，金葉接骨木Sambucus canadensis‘Aurea' 1 株，花葉接骨木Sambucus nigra‘Variegata' 1 株，金羽接骨木Sambucus racemosa‘Plumosa Aurea' 1 株， 接骨木Sambucus williamsii2 株），DNA 采用英芮誠生化科技（上海）有限公司植物組織基因組DNA 提取試劑盒提?。ù胖榉ǎ20]，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光PCR 擴(kuò)增體系及程序優(yōu)化

以上述8 個(gè)接骨木成熟葉片進(jìn)行引物篩選。熒光引物PCR 擴(kuò)增體系采取半巢式PCR，經(jīng)降低退火溫度及進(jìn)行梯度PCR 擴(kuò)增等優(yōu)化過程獲得最佳熒光PCR 擴(kuò)增體系及程序。

擴(kuò)增產(chǎn)物利用毛細(xì)管電泳檢測：取PCR 產(chǎn)物0.3 μL、分子量內(nèi)標(biāo)0.5 μL 和去離子甲酰胺9.5 μL混合加入PCR 板，95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻后離心，1×Buffer 緩沖液上機(jī)檢測[21]。

1.6 熒光SSR 引物篩選

100 對熒光引物來源于Primer 3.0 軟件設(shè)計(jì)所得，由北京市睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，純化方式PAGE。引物篩選原則為Tm 值范圍：55～62 ℃；引物重復(fù)堿基的個(gè)數(shù)：2 bp，如（AG），（AT）等；重復(fù)堿基的次數(shù)：8～11 次；PCR 擴(kuò)增體系及程序選自實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組中SSR 的分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

通過對西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組的257 975 條Unigene序列進(jìn)行搜索（序列總長254 175 kb），發(fā)現(xiàn)其中51 336 條Unigene 序列中含有64 148 個(gè)SSR 位點(diǎn)，SSR 位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為24.87%（SSR 位點(diǎn)數(shù)與總的Unigene 數(shù)的比值），平均每3.96 kb 出現(xiàn)1 個(gè)SSR，SSR 的類型豐富，其中，單核苷酸重復(fù)是主要類型，占總SSR 的51.13%。其次是二、三核苷酸重復(fù)，分別占總SSR 的38.63%和9.11%。A/T和AG/CT 是單核酸和二核苷酸的優(yōu)勢重復(fù)基元。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的0.86%、0.1%和0.17%（表1，圖1）。

表1 西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組不同SSR 重復(fù)單元類型分布Table1 Distribution of different SSR repeat types of transcriptome in Sambucus nigra

圖1 SSR 位點(diǎn)分布Fig.1 SSR locus distribution

2.2 熒光PCR 擴(kuò)增體系及程序優(yōu)化

以西洋接骨木葉片DNA 為模板，根據(jù)SSRPCR 的基本條件和擴(kuò)增程序優(yōu)化PCR 體系[18,22-23]。

熒光引物PCR 擴(kuò)增體系及程序如下：

加M13接頭PCR 擴(kuò)增體系：20 μL PCR 體系中含DNA 原液1 μL，2×Mix 10 μL，10 μM 的M13接頭及上下游引物各0.2、0.1、0.3 μL，H2O 8.4 μL；

熒光引物PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；然后進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s（退火溫度因不同引物而異），72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸10 min。

以上述擴(kuò)增體系及程序?yàn)榛A(chǔ)條件，經(jīng)降低退火溫度及進(jìn)行梯度PCR 擴(kuò)增等優(yōu)化過程獲得最佳熒光PCR 擴(kuò)增體系及程序如下：

兩步熒光引物PCR 擴(kuò)增法：

1）加M13接頭PCR 擴(kuò)增體系：10 μL PCR 體系中含DNA 原液1 μL，2×Mix 5 μL，10 μM 引物各0.1 μL，H2O 3.8 μL；PCR 擴(kuò)增程序見表2。

表2 PCR 擴(kuò)增程序Table2 Procedure of PCR amplification

由于第一步與熒光接頭引物結(jié)合擴(kuò)增結(jié)果較差，而兩步法可提高與熒光引物結(jié)合度，可大大提高引物的擴(kuò)增效率。

2）第二步熒光引物PCR 擴(kuò)增體系：20 μL PCR 體系中含第一步擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 原液2 μL，2×Mix 10 μL，10 μM M13 接頭（加熒光標(biāo)記）及反向引物各0.15 μL，H2O 7.7 μL；熒光引物PCR擴(kuò)增程序見表3。

表3 熒光引物PCR 擴(kuò)增程序Table3 Procedure of fluorescent PCR amplification

2.3 熒光SSR 標(biāo)記篩選

對含SSR 位點(diǎn)的51 336 條Unigene 序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了64 148 對SSR 引物。為了驗(yàn)證其有效性，挑選合成了以二核苷酸重復(fù)基元為主的100 對熒光SSR 引物，利用已合成的100 對引物對8份不同種接骨木個(gè)體進(jìn)行熒光SSR擴(kuò)增，結(jié)果表明，80 對引物擴(kuò)增有條帶，即擴(kuò)增效率為80%。在擴(kuò)增成功的80 對引物中有25 對引物多態(tài)性較好，即引物多態(tài)性效率為31.25%。圖2為5號引物在8 份不同種接骨木個(gè)體中的擴(kuò)增情況。

2.4 熒光SSR 標(biāo)記多態(tài)性

從25 對擴(kuò)增有多態(tài)性的引物中選取14 對多態(tài)性較好的引物（表4）對不同種接骨木進(jìn)行遺傳多樣性分析并對熒光標(biāo)記多態(tài)性進(jìn)行評價(jià)。14對多態(tài)性引物共檢測出67 個(gè)等位基因（Na），每位點(diǎn)3～7 個(gè)，平均等位基因4.786 個(gè)；每位點(diǎn)有效等位基因數(shù)（Ne）1.684～6.095 個(gè)，平均有效等位基因數(shù)3.413 個(gè)，觀測雜合度（Ho）及期望雜合度（He）分別在0～0.875 和0.406～0.836之間，平均值分別為0.313、0.664；Shannon 多樣性指數(shù)(I)在0.736～1.862 之間，平均1.310 （表5），說明不同種接骨木具有較高的遺傳多樣性。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展及成本優(yōu)勢，轉(zhuǎn)錄組測序所得數(shù)據(jù)可包含某物種特定時(shí)期某一組織或器官的轉(zhuǎn)錄本[24-25]，對于缺乏基因組信息的物種，其轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ谠撐锓N分子標(biāo)記開發(fā)及標(biāo)記輔助育種是一個(gè)的短平快的方法。

本研究中，對一株成熟西洋接骨木果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序所得cDNA 文庫中的257 975 條Unigene進(jìn)行SSR 搜索，得到了64 148 個(gè)SSR 位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為 24.87%，此頻率高于蘿卜的23.79%[26]、皂莢的20.7%[27]、刺梨的20.37%[19]、南方紅豆杉的2.24%[18]、但低于芙蓉李的54.51%[28]，厚樸的52.75%[29]，出現(xiàn)這種差異可能是由轉(zhuǎn)錄組測序方法，不同物種間SSR 位點(diǎn)信息差異、SSR 位點(diǎn)查找軟件、不同數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)量大小等原因造成的[18,30]。隨著不同數(shù)據(jù)庫的不斷補(bǔ)充和完善，SSR 出現(xiàn)頻率在各數(shù)據(jù)庫中將有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[19]。在大多數(shù)物種中二核苷酸和三核苷酸是最常見的SSR 重復(fù)類型[31]，而從西洋接骨木SSR 位點(diǎn)結(jié)構(gòu)來看，單核苷酸（51.13%）出現(xiàn)頻率最高，明顯高于二核苷酸（38.63%）和三核苷酸（9.11%），這與鄢秀芹等對刺梨的SSR 重復(fù)類型研究并不一致：三核苷酸出現(xiàn)頻率最高，高于四核苷酸及二核苷酸[19]；西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組中二核苷酸優(yōu)勢重復(fù)基元是 AG/CT，這與青稞[32]、刺梨[19]、藍(lán)靛果[33]、芝麻[34]中有一致的研究結(jié)論。

圖2 8 個(gè)樣本在5 號位點(diǎn)的基因型 Fig.2 Genotypes of 8 samples at No.5 SSR locus

根據(jù)257 975 條Unigene 序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了64 148 對SSR 特異引物。通過試驗(yàn)優(yōu)化方案得到了西洋接骨木熒光SSR-PCR 最優(yōu)體系，在合成的100 對SSR 熒光標(biāo)記中，80 對標(biāo)記擴(kuò)增有特異條帶出現(xiàn)，20 對未擴(kuò)增出條帶，部分標(biāo)記擴(kuò)增失敗可能與引物及模板質(zhì)量有關(guān)[35-36]。80 對有擴(kuò)增條帶的引物中25 對引物具有較好多態(tài)性，多態(tài)性比率為31.25%，明顯低于鐵皮石斛的86%[37]、柿樹的45.2%[38]、低于紅豆杉的38.71%[18]，但高于芝麻的10%[39]，而對于西洋接骨木近緣種分子標(biāo)記相關(guān)內(nèi)容未見研究報(bào)道。綜上，不同物種間引物的多態(tài)性比率并不一致，這可能與標(biāo)記類型、參試實(shí)驗(yàn)材料及數(shù)量有關(guān)。從SSR 位點(diǎn)多態(tài)性潛能考慮[40]，本研究從25 對有擴(kuò)增產(chǎn)物的SSR 標(biāo)記中篩選出的14 對引物具有較高的多態(tài)性，用于接骨木遺傳變異研究是可行的，本研究結(jié)果也表明利用西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR 標(biāo)記為接骨木種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的挖掘等奠定了基礎(chǔ)[14-16]。本研究用14 對標(biāo)記評價(jià)8 個(gè)不同種接骨木遺傳多樣性具有一定局限性，下一步工作將擴(kuò)大引物篩選范圍，增加檢測群體的數(shù)量，以期獲得更多多態(tài)性較高的標(biāo)記來驗(yàn)證本研究結(jié)論。轉(zhuǎn)錄組測序獲得的大量SSR 引物將會(huì)為接骨木和其它忍冬科植物的資源分類、基因定位及比較基因組學(xué)等研究提供更多、更有效的分子標(biāo)記。

表4 14 對SSR 引物與最佳退火溫度Table4 14 pairs of SSR primers and optimal annealing temperature

表5 不同種接骨木遺傳多樣性分析Table5 Analysis of genetic diversity of Sambucus williamsil in different populations

3.2 結(jié) 論

本研究利用高通量測序?qū)ξ餮蠼庸悄具M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對數(shù)據(jù)中SSR 位點(diǎn)分布、核苷酸重復(fù)類型進(jìn)行概括總結(jié)；通過試驗(yàn)優(yōu)化獲得最優(yōu)的兩步熒光引物PCR 擴(kuò)增體系；根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中合成100 對熒光SSR 標(biāo)記，利用8個(gè)不同種接骨木個(gè)體對100 對熒光標(biāo)記進(jìn)行引物篩選，80 對可擴(kuò)增出條帶，25 對可成功擴(kuò)增出多態(tài)性，選擇14 對多態(tài)性較好的引物對不同種接骨木進(jìn)行遺傳多樣性預(yù)測。西洋接骨木熒光SSR 標(biāo)記的開發(fā)為接骨木屬分子標(biāo)記輔助育種、雜種優(yōu)勢預(yù)測等提供理論基礎(chǔ)。