劉威良 黃艾祥

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 云南昆明650201;2昆藥集團(tuán)股份有限公司 云南昆明650100)

睡眠是人體不可或缺的生命活動之一，猶如進(jìn)食、進(jìn)水一樣是一個主動的生理與心理過程，并非疲勞引起的結(jié)果［1］。隨著社會的高速發(fā)展，各行業(yè)競爭不斷加劇，生活節(jié)奏快，生活不規(guī)律，導(dǎo)致失眠的發(fā)病率呈逐年上升且趨于低齡化，引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的重視［2］。失眠癥是指患者對睡眠時間和質(zhì)量的不滿意進(jìn)而影響白天社會日常的一種主觀體驗(yàn)，是一種常見的睡眠障礙，其發(fā)生涉及諸多因素的影響，但均表現(xiàn)為機(jī)體正常睡眠—覺醒節(jié)律的紊亂，繼而引發(fā)神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫功能異常，危害人們的身心健康［3］。長期失眠不僅會影響人們正常的生活、工作、學(xué)習(xí)狀態(tài)，還使人易產(chǎn)生焦慮、狂躁、抑郁、記憶力減退、認(rèn)知障礙等不良精神癥狀，進(jìn)而引發(fā)相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查研究表明，平均每3個成年人中存在一人飽受睡眠障礙的困擾，我國大約占據(jù)45.5%的人群存在不同程度的睡眠問題［4］。

目前臨床上治療失眠的手段還主要依賴于化學(xué)類藥物，如GABAA受體的激動劑苯二氮卓類藥物、巴比妥類藥物；褪黑素受體激動劑類藥物；非苯二氮卓類受體激動劑催眠藥物等，這些中樞鎮(zhèn)靜類藥物雖然效果較佳，但易產(chǎn)生諸如成癮性、戒斷癥狀明顯及藥物依賴性等不良副作用［5］。綜上可知，現(xiàn)行的治療失眠癥的藥物都存在某些不足之處，近年來研究重心轉(zhuǎn)向從一些藥食同源植物提取物中尋找治療失眠的功能因子。

天麻，蘭科天麻屬植物天麻（Gastrodia elataBlume）的根莖，又名赤箭、定風(fēng)草，主產(chǎn)于我國云南、四川、西藏等地，具有息風(fēng)止痙、平肝潛陽等功效，是一味名貴的中藥材［6］。研究表明，天麻含有天麻苷、甾醇、有機(jī)酸、多糖等活性物質(zhì)，其中含量最高且有效的單體成分是天麻苷（化學(xué)名為對羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，別稱天麻素），具有抗炎、解痙鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗癲癇、降壓、保護(hù)心臟、增加椎-基底動脈供血等生理功效［7］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦表明，天麻素對人體免疫系統(tǒng)［8］、心血管系統(tǒng)［9］及中樞神經(jīng)系統(tǒng)［10］等方面均發(fā)揮較好的藥理活性，因此，對其藥理活性的研究意義重大。隨著人們對天麻素藥理作用的重視及其研究的不斷深入，目前已開發(fā)出天麻素片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射液等劑型的產(chǎn)品，其中天麻素注射液在臨床研究上應(yīng)用較為廣泛，它是采用現(xiàn)代制藥技術(shù)研制而成的單體制劑，主要用于治療神經(jīng)衰弱綜合征、心悸、心肌缺血、血管神經(jīng)性頭痛、眩暈癥、椎基底動脈供血不足、前庭神經(jīng)元炎等病癥［11-12］。

基于以上天麻素注射液的應(yīng)用及其文獻(xiàn)考究，其對失眠的藥理學(xué)研究鮮見報道，本實(shí)驗(yàn)采用昆藥集團(tuán)股份有限公司自主研發(fā)的天眩清牌天麻素注射液，對動物的鎮(zhèn)靜催眠作用進(jìn)行初步探討，為天麻素用于防治失眠多夢及其具有改善睡眠功效的保健食品、藥膳等的開發(fā)提供藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，提高天麻的附加值，開拓其資源的利用空間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級ICR小鼠，雄性，體重（18～22 g），采購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證為：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2 試劑及儀器

1.1.2.1 試劑

戊巴比妥鈉（Sigma，上?；瘜W(xué)試劑分裝廠進(jìn)口分裝，批號：F20160721）；艾司唑侖片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號：20180605）；天眩清牌天麻素注射液（云南昆藥集團(tuán)股份有限公司，批號：20180910）；戊四氮（天津希恩思生化科技有限公司，批號：20180915）；士的寧（四川維克奇生物科技有限公司，批號：20180712）；印防己毒素（上海麥克林生化科技有限公司，批號：20180823）；羧甲基纖維素鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：F20170909）；二甲基亞砜 （Sigma，批號：D2650）；生理鹽水（廣州市鴻洲實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司，批號：20181107）；所用其他試劑均為分析純。

1.1.2.2 儀器

ZZ-6小鼠自主活動測試儀（成都泰盟科技有限公司）；CP153電子天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；LC-162C海爾冰箱（青島海爾集團(tuán)）；秒表（深圳市惠波工貿(mào)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 對小鼠自發(fā)活動的影響

按照人臨床用藥劑量折算成小鼠給藥劑量，將小鼠隨機(jī)分為5個組，確保組間體重?zé)o顯著性差異（p＞0.05），每組11只，即天麻素注射液高劑量組（200 mg/kg）、天麻素注射液中劑量組（100 mg/kg）、天麻素注射液低劑量組（50 mg/kg）、艾司唑侖片組（2 mg/kg）、空白組，其中天麻素注射液組小鼠給予腹腔注射（給藥體積為10 mL/kg），空白組灌胃給予0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液（給藥體積為20 mL/kg），艾司唑侖片組灌胃給藥（給藥體積為20 mL/kg）。以上各組連續(xù)給藥7 d開始實(shí)驗(yàn)，給藥期間觀察各組小鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、飲食與糞便有無異常，于末次給藥后30 min，將小鼠放入自主活動記錄儀的小室內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境3 min，然后用自主活動儀連續(xù)記錄5 min內(nèi)小鼠自主活動次數(shù)［13］。為減小系統(tǒng)誤差，所有實(shí)驗(yàn)均采用平行操作。

1.2.2 對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠作用的影響

1.2.2.1 對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠率的影響

取55只小鼠，分組給藥方法同“1.2.1”。末次給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾下劑量（30 mg/kg），以小鼠反正反射消失1 min以上者則記為入睡，觀察并統(tǒng)計注射戊巴比妥鈉后15 min內(nèi)各組小鼠的入睡百分比［14］。為減小系統(tǒng)誤差，所有實(shí)驗(yàn)均采用平行操作。

1.2.2.2 對閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響

取55只小鼠，分組給藥方法同“1.2.1”。末次給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾劑量（50 mg/kg），用秒表觀察并記錄小鼠睡眠潛伏期（從注射戊巴開始至小鼠反正反射消失的時間）和睡眠持續(xù)時間（從小鼠翻正反射消失至恢復(fù)正常活動的時間）［15］。為減小系統(tǒng)誤差，所有實(shí)驗(yàn)均采用平行操作。

1.2.3 對戊四唑誘導(dǎo)驚厥的影響

取55只小鼠，分組給藥方法同“1.2.1”。末次給藥30 min后腹腔注射戊四唑溶液（80 mg/kg），觀察并記錄各組小鼠驚厥請況及死亡請況［16］。為減小系統(tǒng)誤差，所有實(shí)驗(yàn)均采用平行操作。

1.2.4 對印防己毒素誘導(dǎo)驚厥的影響

取55只小鼠，分組給藥方法同“1.2.1”。末次給藥30 min后腹腔注射印防己毒素溶液（10 mg/kg），觀察并記錄各組小鼠驚厥請況及死亡請況［17］。為減小系統(tǒng)誤差，所有實(shí)驗(yàn)均采用平行操作。

1.2.5 對士的寧誘導(dǎo)驚厥的影響

取55只小鼠，分組給藥方法同“1.2.1”。末次給藥30 min后腹腔注射士的寧溶液（1.6 mg/kg），觀察并記錄各組小鼠驚厥請況及死亡請況［18］。為減小系統(tǒng)誤差，所有實(shí)驗(yàn)均采用平行操作。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS18統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，所得數(shù)據(jù)以（x±S）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，p＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠自主活動的影響

研究結(jié)果顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯抑制小鼠的自主活動次數(shù)，且具有非常顯著性差異（p＜0.001）；天麻素注射液高、中、低劑量組均能抑制小鼠的自主活動次數(shù)，且有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），表明其具有一定的中樞鎮(zhèn)靜作用。結(jié)果見表1。

表1 天麻素注射液對小鼠自主活動的影響（±s）

表1 天麻素注射液對小鼠自主活動的影響（±s）

說明：“*”為 p＜0.05，“**”為 p＜0.01，“***”為 p＜0.001。下同。

組別 劑量 活動次數(shù)/次（115.36±13.54）（45.36±38.55）***（93.64±16.99）**（94.55±27.17）*（99.36±19.22）*空白艾司唑侖片天麻素注射液高劑量天麻素注射液中劑量天麻素注射液低劑量數(shù)量/只11 11 11 11 11 20 mL 2 mg 200 mg 100 mg 50 mg

2.2 對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠作用的影響

2.2.1 對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠率的影響

研究結(jié)果顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致的睡眠小鼠的數(shù)量，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01）；天麻素注射液高、中、低劑量組均能不同程度的增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致的睡眠小鼠的數(shù)量，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），表明天麻素注射液對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠有一定的協(xié)同作用，結(jié)果見表2。

2.2.2 對閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響

研究結(jié)果顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯縮短閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠的入睡潛伏期時間，延長小鼠睡眠時間，且具有非常顯著性差異（p＜0.001）；天麻素注射液各劑量組均能不同程度的縮短閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠的入睡潛伏期時間，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），同時明顯延長小鼠睡眠時間，且具有非常顯著性差異（p＜0.001），表明其具有協(xié)同戊巴比妥鈉促進(jìn)動物睡眠的效果，結(jié)果見表3。

表2 天麻素注射液對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠小鼠的影響

表3 天麻素注射液閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響（±s）

表3 天麻素注射液閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響（±s）

組別空白艾司唑侖片天麻素注射液高劑量天麻素注射液中劑量天麻素注射液低劑量數(shù)量/只11 11 11 11 11劑量20 mL 2 mg 200 mg 100 mg 50 mg入睡潛伏期/min（10.73±8.73）（2.39±0.27）***（3.63±0.40）**（4.10±1.20）*（4.38±1.00）*睡眠持續(xù)時間/min（28.76±15.61）（175.37±33.10）***（72.99±28.23）***（75.88±14.72）***（57.90±17.51）***

2.3 對戊四唑誘導(dǎo)驚厥的影響

研究結(jié)果顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯降低戊四氮致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01）；天麻素注射液各劑量組均能不同程度的降低戊四氮致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01），表明天麻素注射液對中樞興奮劑戊四唑有一定的拮抗作用，結(jié)果見表4。

表4 天麻素注射液對戊四唑誘導(dǎo)小鼠驚厥的影響

2.4 對印防己毒素誘導(dǎo)驚厥的影響

研究結(jié)果顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯降低印防己毒素誘導(dǎo)小鼠驚厥的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01）；天麻素注射液各劑量組均能不同程度的降低印防己毒素致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01），表明天麻素注射液對中樞興奮劑印防己毒素有一定的拮抗作用，結(jié)果見表5。

表5 天麻素注射液對印防己毒素誘導(dǎo)小鼠驚厥的影響

2.5 對士的寧誘導(dǎo)驚厥的影響

研究結(jié)果顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯降低士的寧誘導(dǎo)小鼠驚厥的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01）；天麻素注射液各劑量組均能不同程度的降低士的寧致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），表明天麻素注射液對中樞興奮劑士的寧有一定的拮抗作用，結(jié)果見表6。

表6 天麻素注射液對士的寧誘導(dǎo)小鼠驚厥的影響

3 討論

失眠是困擾現(xiàn)代人最常見病癥之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且趨于低齡化［19］。一些中藥因其毒副作用小及在鎮(zhèn)靜催眠方面表現(xiàn)出良好的效果，備受廣大醫(yī)學(xué)研究者們青睞。天麻作為我國傳統(tǒng)名貴中藥之一，主產(chǎn)于云南、四川、貴州等地，在我國有悠久的應(yīng)用歷史，歷代草本文獻(xiàn)中記載其具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)通絡(luò)、平抑肝陽等功效；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗癲癇、抗抑郁、鎮(zhèn)痛及鎮(zhèn)靜催眠等功效，臨床上主要用于治療高血壓、高血栓、冠心病眩暈癥、腦缺血后遺癥、神經(jīng)衰弱等心腦血管疾病。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)天麻中的主要活性物質(zhì)天麻素可通過作用于GABAergic能神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，效果頗佳且不產(chǎn)生藥物依賴性［20-21］。唐慶等［22］以ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，連續(xù)灌胃給予天麻鉤藤膠囊5 d后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天麻鉤藤膠囊有一定的鎮(zhèn)靜催眠效果。國內(nèi)學(xué)者陳鵬等［23］，選擇小鼠開展實(shí)驗(yàn)，連續(xù)灌胃小鼠天麻醒腦膠囊5 d后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天麻醒腦膠囊具有明顯的鎮(zhèn)靜及催眠作用。

睡眠是個涉及多系統(tǒng)、多中樞、較為復(fù)雜的生理過程，長期以來人們對鎮(zhèn)靜催眠類藥物研究的方法不盡相同，但大體上趨向一致，其中動物自主活動情況的檢測是評估精神類藥物最為常用、方便的實(shí)驗(yàn)方法，它能很好的反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能狀態(tài)（興奮或抑制），是一項(xiàng)重要的檢測指標(biāo)［24］。本研究數(shù)據(jù)顯示，天麻素注射液不同劑量組均能顯著減少小鼠自主活動（p＜0.05或p＜0.01），且呈現(xiàn)出量效關(guān)系，表明其具有一定的中樞鎮(zhèn)靜作用。戊巴比妥鈉是巴比妥類催眠藥，常應(yīng)用于動物麻醉實(shí)驗(yàn)中，其作用機(jī)制與GABAA受體有關(guān)，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中常利用藥物與戊巴比妥鈉的協(xié)同作用來評價鎮(zhèn)靜催眠作用情況［25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天麻素注射液不同劑量組均能明顯提高小鼠的入睡率（p＜0.05或p＜0.01）、顯著縮短閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期并延長其睡眠持續(xù)時間 （p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001），且呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系，其發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的具體作用機(jī)制是否與GABAA受體有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

人大腦中存在著甘氨酸（Glycin）和γ-氨基丁酸（GABA）兩種抑制性氨基酸，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制穩(wěn)態(tài)平衡發(fā)揮著重要調(diào)控作用［26］。戊四唑，又稱戊四氮，是一種中樞興奮性藥物，臨床上主要用于解救麻醉藥及巴比妥類藥物中毒，動物實(shí)驗(yàn)中常作為一種驚厥反應(yīng)的誘導(dǎo)劑。研究表明，戊四唑通過拮抗抑制性氨基酸γ-氨基丁酸（GABA）在突出間傳遞作用，引發(fā)神經(jīng)毒性反應(yīng)產(chǎn)生驚厥作用［27］。本研究數(shù)據(jù)顯示，不同劑量的天麻素注射液可以對抗戊四唑誘導(dǎo)的驚厥，顯著降低小鼠的致死率（p＜0.05或p＜0.01），表明其可能通過GABAergic能神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮中樞抑制作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步考察。

印防己毒素是一種非競爭性離子通道阻斷劑，作用于GABAA受體，臨床上用于解救巴比妥類藥物中毒，劑量過大可導(dǎo)致興奮大腦中樞神經(jīng)和脊髓神經(jīng)引發(fā)驚厥，亦可加強(qiáng)嗎啡興奮脊髓神經(jīng)誘發(fā)驚厥［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，天麻素注射液各劑量組均能不同程度的降低印防己毒素致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.01），這可能與其激動GABAA受體產(chǎn)生中樞抑制作用，對此驚厥反應(yīng)表現(xiàn)出一定的拮抗作用，具體作用機(jī)制有待下一步考察。士的寧又稱番木鱉堿，是從我國傳統(tǒng)中藥馬錢子中提取出來的一種生物堿，它能選擇性興奮脊髓，增強(qiáng)骨骼肌緊張度，臨床上用于治療弱視、偏癱、巴比妥類藥物中毒、血液病以及鏈霉素的毒性反應(yīng)，劑量過大時其可直接作用于脊髓和腦干拮抗抑制性氨基酸（Glycin）的分泌，引發(fā)肌肉痙攣進(jìn)而產(chǎn)生驚厥反應(yīng)［28］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，天麻素注射液各劑量組均能不同程度的降低士的寧致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05或p＜0.01），表明其可通過作用于Glycinergic通路，發(fā)揮中樞鎮(zhèn)靜作用，拮抗士的寧誘導(dǎo)的驚厥，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步考察。

綜上所述，本研究采用小鼠自主活動、藥物與戊巴比妥鈉協(xié)同作用及對抗中樞興奮劑等經(jīng)典的鎮(zhèn)靜催眠模型綜合評價藥物的中樞鎮(zhèn)靜作用［29］，初步考察了不同給藥劑量的天麻素注射液對小鼠鎮(zhèn)靜催眠及對抗中樞興奮劑誘導(dǎo)的驚厥作用，結(jié)果表明天麻素注射液能夠降低正常小鼠的自發(fā)活動、對戊巴比妥鈉促進(jìn)動物睡眠有一定的協(xié)同促進(jìn)作用、對各種致驚厥劑誘導(dǎo)的驚厥反應(yīng)有很好的對抗效果，表明其有一定的中樞鎮(zhèn)靜作用，其具體作用機(jī)制有待后期考察。目前，我國食品藥品監(jiān)督管理局總局共批準(zhǔn)具有“睡眠改善”功效的保健食品515種、進(jìn)口保健食品48種，主要是含褪黑素類物質(zhì)的產(chǎn)品，其余產(chǎn)品主要以養(yǎng)心安神及滋陰補(bǔ)腎中藥為主［30］。天麻這種傳統(tǒng)名貴中藥，按照中醫(yī)基礎(chǔ)理論知識劃歸為息風(fēng)止痙藥，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其還有很好的鎮(zhèn)靜催眠作用，云南昭通市是天麻的主產(chǎn)區(qū)，且其中所含天麻素等活性物質(zhì)遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)區(qū)。本研究通過探討天麻素注射液對動物的鎮(zhèn)靜催眠作用，可為天麻系列藥膳（如天麻汽鍋雞）及保健食品的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，增加天麻附加值，拉動地方經(jīng)濟(jì)水平上升，實(shí)現(xiàn)資源開發(fā)再利用；同時也為天麻素注射液用于臨床防治失眠多夢提供藥效學(xué)依據(jù)，減緩失眠患者痛苦，提高并改善其生活質(zhì)量。