寧龍龍　劉佳佳　趙昆昆　李柯　李忠峰　馬興立　張幸果　殷冬梅

摘要：本試驗以花生品系花7616為父本、H1338為母本雜交得到的F1代群體為材料，利用AhMITE標記對F1代真?zhèn)坞s種進行鑒定。結果表明：F1代群體78個單株中有8株呈現(xiàn)母本單一條帶，50株呈現(xiàn)父本單一條帶，20株是雙親雜合帶型;結合父母本葉片表型特征，共有20個單株鑒定為真雜種，真雜種率為25.64%，與分子標記鑒定結果一致。綜上，利用轉座子分子標記可以準確地對雜交后代進行鑒定，進而為高世代RIL群體的構建奠定基礎。

關鍵詞：花生;雜種鑒定;轉座子標記

中圖分類號：S565.203.53文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0063-05

Identification of Peanut F1 Authentic Hybrids by

AhMITE Transposon Markers

Ning Longlong， Liu Jiajia， Zhao Kunkun， Li Ke， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei

（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract This experiment used peanut line H1338 as female parent and Hua 7616 as male parent to identify the true and false F1 hybrids by AhMITE markers. The results showed that 8 of the 78 individual plants in F1 population showed a single band of female parent， fifty showed a single band of male parent， and 20 showed heterozygous bands of parents. Combined with the phenotypic characteristics of parents leaves， a total of 20 individual plants were identified as true hybrids， and the rate of true hybrids was 25.64%， which was consistent with the results of molecular marker identification. In conclusion， transposon molecular markers could accurately identify hybrid offspring， which laid foundations for the construction of high-generation RIL populations.

Keywords Peanut; Hybrid identification; Transposon marker

花生是重要的油料作物之一，不僅含油量高、營養(yǎng)價值豐富，還可以培肥土力、生物固氮。雜交育種是花生主要的育種方法，可通過基因重組綜合雙親優(yōu)良性狀，基因累加產生超親性狀，基因互作產生新性狀，使育種工作更具有目的性和創(chuàng)造性。

花生雜交F1代真假雜種鑒定常用傳統(tǒng)鑒定法和分子鑒定法。傳統(tǒng)鑒定法的優(yōu)點是簡便、直觀，但存在鑒定時間長、易受環(huán)境條件影響、可用形態(tài)標記數量有限等缺點。隨著分子生物技術的迅速發(fā)展，各種分子鑒定法不斷創(chuàng)新。分子標記是傳統(tǒng)遺傳標記的發(fā)展，利用分子標記技術可使許多以前無法進行的研究得以實現(xiàn)。常見的分子標記有4類，第1類為基于DNA雜交的分子標記，主要有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）標記、可變數目串聯(lián)重復序列（VNTR）標記;第2類為基于聚合酶鏈式反應的分子標記，包括隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）標記、簡單序列重復（SSR）標記、序列特征性擴增區(qū)域（SCAR）標記、序列標簽位點（STS）等;第3類為PCR與限制性酶切技術相結合的分子標記，主要有擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）、酶切擴增多態(tài)性序列（CAPS）;第4類為基于基因組測序技術開發(fā)的分子標記，主要有單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入缺失標記（In-Del）。目前，分子標記應用于構建遺傳連鎖圖譜、基因定位、種質資源的鑒定及分類和輔助選擇育種等多個方面。

轉座子標記是一種以PCR技術為基礎的分子標記[1]。轉座子又稱為可移動因子，是指一段特定的DNA序列，可在染色體組內移動，從一個位點切除插入到一個新的位點。微型反向重復轉座元件（miniature inverted repeat transposable elements）簡稱MITE元件，是近年來在植物、細菌和動物基因組中發(fā)現(xiàn)的一種非自主轉座的可轉座DNA元件。它的結構組織和DNA轉座子具有相似的地方，兩端含有倒置重復序列（terminal inverted repeats，TIR），所處位點處具有正向重復（tandem short duplication，TSD）;不同之處在于位于TIR之間的DNA序列不編碼轉座所需的轉座酶，也不一定編碼功能性的基因產物。

AhMITE（微型倒轉重復轉座子）標記即AhTE標記，具有穩(wěn)定、重復性好、多態(tài)性高、操作簡單、耗時短等優(yōu)點。Patel等[2]報道花生MITE的插入導致ahFAD2B功能異常而產生高油酸花生突變體。王潔等[3]用MITE對花生不同雜交組合的F1代進行鑒定。Gowda、俞朝、溫小杰等[4-6]認為采用AhMITE標記鑒定的花生擴增產物片段差異大，利用瓊脂糖凝膠電泳就可區(qū)分真假雜種，很大程度上提高了育種效率。為了對雜交后代進行真?zhèn)坞s種鑒定，從而為高世代RIL群體構建奠定基礎，本研究選擇葉片表型性狀與AhMITE分子標記相結合的方法，對花生品系花7616（父本）、H1338（母本）的F1代雜種進行真?zhèn)舞b定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用花生品系花7616（父本）、H1338（母本）雜交得到的F1群體為材料。親本均為河南農業(yè)大學花生課題組選育的純合自交系。

1.2 花生葉片DNA的提取

取新鮮葉片0.1 g 裝入2.0 mL的離心管中，置于液氮中速凍并充分研磨后加入800 μL的SLS提取液（pH=8.0），顛倒混勻20 min;加入等體積現(xiàn)配的酚+氯仿+異戊醇（25∶[KG-*2/3]24∶[KG-*2/3]1），顛倒混勻20 min;12 000 r/min離心10 min，吸取上清液至1.5 mL離心管中，加入等體積預冷異丙醇混勻，-20℃靜置1 h;12 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，用75%乙醇漂洗2～3次，95%乙醇漂洗1次，晾干后加入適量ddH2O溶解，并對得到的DNA進行相關質量檢測。

1.3 花生親本AhMITE標記的篩選

選取9對AhMITE引物（表1）對親本進行多態(tài)性分析，選出能夠使雙親擴增產物存在顯著差異且條帶清晰穩(wěn)定的引物進行F1代雜種鑒定。

1.4 花生雜交F1代群體鑒定

利用篩選出的引物對F1群體進行PCR擴增，同時擴增雙親，通過比較鑒別F1代真?zhèn)坞s種。PCR反應體系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix為10 μL ，模板DNA為1 μL，上、下游引物各1 μL，加入ddH2O至總體積達20 μL。PCR反應程序：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán);72℃延伸7 min，待循環(huán)完成后4℃保存。PCR擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照保存。

2 結果與分析

2.1 F1代群體DNA提取

經分光光度計檢測可得，提取的DNA OD260/280均為1.8～2.0，OD260/230均為2.0左右，說明DNA提取質量較好，可進行后續(xù)試驗。對提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示，待測樣品均能跑出明亮單一條帶。

2.2 AhMITE多態(tài)性標記引物的篩選

由圖2可知，本試驗設計的9對引物均可擴增出條帶。其中，引物AhTE0015、AhTE0016、AhTE0018各擴增出2條帶型，不同親本中2條帶型均相同;引物AhTE0029、AhTE0078、AhTE0394、AhTE0389、AhTE0254、AhTE0191均在雙親中擴增出1條帶型，經分析發(fā)現(xiàn)，僅有引物AhTE0389擴增的雙親帶型存在顯著差異，母本帶型分子量為600 bp，父本帶型為300 bp。因此，本研究選用引物AhTE0389作為標記專用引物。

2.3 F1代群體真假雜種鑒定

2.3.1 F1代群體表型鑒定 由圖3可以看出，不同親本的葉形存在差異：母本H1338的葉片較小，頂端向內凹陷呈扇形，葉緣從基部到頂端基本呈直線;父本花7616葉片相對較大呈橢圓形，葉片從基部到頂端呈現(xiàn)一定弧度。因此，雜交F1代的表型應介于兩者之間，即葉片既向內凹陷，葉緣又有一定弧度。圖3中，F(xiàn)1-3葉型與母本完全一致，為假雜種， F1-4葉型與父本完全一致，為假雜種，F(xiàn)1-1、 F1-2、 F1-5、 F1-6表型介于父母本之間，鑒定為真雜種。根據葉片表型鑒定結果，F(xiàn)1代群體78個單株中有8株與母本葉型完全一致，50株與父本葉型完全一致，20株葉型介于兩者之間。

2.3.2 轉座子標記鑒定 利用篩選出的引物AHTE0389對78個F1代進行擴增，若F1擴增的條帶同時含有父母本的帶型則為真雜種，若只有母本的一條帶型則為假雜種。擴增結果如圖4所示，編號為1、11、26、29、31、42、53、60的只有母本1條帶型，為假雜種，50個只具有父本的1條帶型，為假雜種;20個具有父母本的雜合帶型，為真雜種。

3 討論與結論

花生真?zhèn)坞s種的鑒定是構建花生遺傳群體的中心一環(huán)，而花生遺傳群體的構建則是選育新品種的基礎，因此鑒定花生真假雜種十分必要。形態(tài)標記法是一種傳統(tǒng)的鑒定方法[7]，通過鑒定F1代表型可分辨真假雜種，但實際操作過程中往往受到多種因素的限制：用于鑒定的形態(tài)學標記數量有限，而且有的標記在一定生育期才能表現(xiàn)出來;標記性狀受環(huán)境影響較大，有些標記性狀與不良性狀發(fā)生連鎖，難以進行鑒定;通過形態(tài)學標記鑒定的雜種第2年要再次種植才能確定鑒定結果是否正確。因此，該方法存在效率較低并且費時的弊端。分子標記直接在DNA水平上反映不同個體間差異[8]，可以在F1代直接鑒別真假雜種，用于鑒定的標記幾乎遍布整個基因組，檢測座位近乎無限，并且自然界存在許多等位變異，無需人工創(chuàng)造突變[9]。此外，分子標記鑒定的多態(tài)性高，不受環(huán)境條件影響，在植物的任何生育期尤其是早期即可進行真假雜種鑒定[10]。

花生真假雜種鑒定通常采用簡單重復序列標記（SSR）[1 12]，鑒定效果較好，但需要經過垂直板聚丙酰胺凝膠電泳比較擴增條帶的遷移距離，并且聚丙酰胺凝膠制膠和跑膠過程較為復雜。此外，利用特異SNP位點鑒定花生F1代真假雜種的結果準確性較高，但對DNA質量要求相對較高[13]。RAPD是一種常用的分子標記方法，一次擴增可產生許多條帶，但重復性及穩(wěn)定性較差。轉座子標記是一種基于PCR的分子標記，其在基因組中的插入或者缺失可引起不同個體間的差異。本試驗用SLS法提取花生DNA ，操作過程簡便、提取效率高、質量好，可以同時進行大批量DNA提取，同時，采用的轉座子標記方法經過瓊脂糖凝膠電泳就可以比較擴增條帶的遷移距離，重復性及穩(wěn)定性好，操作步驟簡單容易掌握。此外，本試驗選擇的性狀在苗期就可表現(xiàn)出來，因此可提前進行雜交后代的篩選，提高了篩選效率;采用表型性狀與分子標記相互結合、互相驗證的方法，可以提高雜種鑒定的效率和構建高世代RIL群體的準確性。

目前，傳統(tǒng)育種技術與分子標記的結合在花生的抗病育種、親緣關系的研究等方面做出巨大貢獻[14，15]。但由于遺傳基礎比較狹窄、分子標記的多態(tài)性較低，花生分子標記技術研究明顯滯后于其它作物[16]。就目前來看，應用最多的是微衛(wèi)星分子標記，但這類標記的技術操作比較復雜[17]。轉座子標記的出現(xiàn)為花生育種開辟了新途徑，相信隨著研究的深入和發(fā)展，轉座子將會在花生品種選育和性狀遺傳改良等方面發(fā)揮重要作用[18]。

參 考 文 獻：

[1]尹亮，任艷，石延茂，等.利用AhMITE1轉座子分子標記鑒定栽培花生雜交F1代種子真?zhèn)蝃J].山東農業(yè)科學， 2015， 47（12）：1-5.

[2]Patel M，Jung S，Moore K，et al. High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into the FAD2 gene[J].Theoretical and Applied Genetics， 2004， 108（8）：1492-1502.

[3]王潔，李雙鈴，王輝，等. 利用AhMITE1轉座子分子標記鑒定花生F1代雜種[J].花生學報，2012， 41（2）：8-12.

[4]Gowda M V C，Bhat R S，Sujay V，et al. Characterization of AhMITE1 transposition and its association with the mutational and evolutionary origin of botanical types in peanut（Arachis spp.）[J].Plant Systematics and Evolution，201 291（3/4）：153-158.

[5]俞朝，馮英.植物MITEs研究進展[J].浙江農業(yè)學報， 2008，20（3）：213-218.

[6]溫小杰，張學勇，郝晨陽，等.MITE轉座元件在植物中的研究進展[J].中國農業(yè)科學，2008，41（8）：2219-2226.

[7]任小平，姜慧芳，廖伯壽，等.花生分子標記的研究進展[J].植物遺傳資源學報，2006，7（3）：368-371.

[8]蘇君偉，于樹濤，史普想，等.花生分子標記的研究進展[J].安徽農業(yè)科學，201 39（10）：5704-5705，5710.

[9]李雙鈴，王輝，任艷，等.利用熒光標記SSR技術鑒定花生F1代雜交種[J].花生學報，2009，38（4）：35-38.

[10]盧圣棟主編.現(xiàn)代分子生物學實驗技術[M].北京 ：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社， 1999：101-136.

[11]胡東青，王秀貞，唐月異，等.利用SSR標記鑒定花生真雜種[J].花生學報，2012，41（4）：22-25.

[12]曹廣英，吳琪，王云云，等.利用SSR標記鑒定花生雜交 F1代真假雜種[J].山東農業(yè)科學，2016，48（1）：7-10， 15.

[13]韓燕，馬登超，劉譯陽，等.利用特異性SNP位點鑒定花生雜交F1代真假雜種[J].山東農業(yè)科學，2016，48（4）：14-17.

[14]趙婷，王俊宏，徐國忠，等.花生高產優(yōu)質育種與生物技術應用的研究進展[J].熱帶作物學報，201 32（11）：2187-2195.

[15]董文召，湯豐收.我國花生優(yōu)質育種的研究進展及育種策略探討[J].中國農學通報，2002，18（2）：77-79.

[16]王傳堂，楊新道，于翔，等.DNA分子標記技術在花生品種鑒定上的應用研究[J].華北農學報，2006，21（S2）：110-113.

[17]李麗娜，付留洋，秦利，等.花生栽培種與野生種（Arachis stenosperma）種間雜種的創(chuàng)制、鑒定與遺傳分析[J].中國油料作物學報，2017，39（2）：137-144.

[18]王傳堂.DNA分子標記技術在花生上的應用研究[J].中國油料作物學報，1999，21（4）：72-76.

收稿日期：2019-07-24

基金項目：國家自然科學基金項目（U1704232）;河南省花生產業(yè)技術體系項目（S2012-05-G03）

作者簡介：寧龍龍（1993—），男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向為花生遺傳育種。E-mail： nllhnnd@outlook.com

通訊作者：殷冬梅（1972—），女，河南南陽人，博士，教授，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail：yindm@126.com