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        花生AhbHLH63基因的克隆與表達分析

        2019-12-09 01:52:35崔維佩谷朝陽唐桂英徐平麗柳展基單雷
        山東農(nóng)業(yè)科學 2019年9期

        崔維佩 谷朝陽 唐桂英 徐平麗 柳展基 單雷

        摘要:bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中起著重要作用。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序結果從栽培種花生豐花1號中克隆得到AhbHLH63基因。序列分析顯示,AhbHLH63基因有兩個剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2,其ORF分別長1 188 bp和1 152 bp ,分別編碼395個氨基酸和383個氨基酸組成的蛋白。親緣關系分析表明,AhbHLH63蛋白含有一個預測的bHLH結構域,與其他植物的bHLH63具有較高的同源性,與苜蓿等的同源蛋白親緣關系較近。實時熒光定量PCR分析表明,AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2表達模式基本一致,均為組成型表達,在花中表達量最高,莖和葉中次之,在根中表達量最低;在花生種子的不同發(fā)育時期,發(fā)育中期表達量較高。

        關鍵詞:花生;bHLH轉(zhuǎn)錄因子;基因克隆;表達分析

        中圖分類號:S565.2:Q785文獻標識號:A文章編號:1001-4942(2019)09-0035-07

        Cloning and Expression Analysis of [WTHX][STHX]AhbHLH63[WTHZ][STHZ] Gene in Peanut

        Cui Weipei , Gu Chaoyang1,3, Tang Guiying1, Xu Pingli1, Liu Zhanji4, Shan Lei1, 2, 3

        (1. Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Shandong Provincial Key Laboratory of

        Crop Genetic Improvement Ecology and Physiology, Jinan 250100, China; 2. College of Life Science, Shandong Normal

        University, Jinan 250014, China; 3. College of Life Sciences, Shandong University, Qingdao 266237, China;

        4. Shandong Cotton Research Center, Jinan 250100, China)

        Abstract bHLH transcription factors play the important roles in regulating plant growth and development. In this study, an AhbHLH[STBX]63 gene was cloned from cultivated peanut variety Fenghua 1 based on the results of transcriptomic sequencing. Sequence analysis showed that the AhbHLH[STBX]63 gene had two kinds of splicesome, AhbHLH[STBX]63-1.1 and AhbHLH[STBX]63-1.2[STBZ], which had the open reading frame as 1 188 bp and 1 152 bp and encoded 395 and 383 amino acids respectively. Phylogenetic analysis indicated that the AhbHLH63 protein contained a predicted bHLH domain, which had high sequence identity with bHLH63 or homologous proteins from other plants, and had the highest similarity with that of alfalfa. Quantitative RT-PCR analysis showed that the expression profile of AhbHLH[STBX]63-1.1 was consistent with that of AhbHLH[STBX]63-1.2[STBZ], which displayed the constitutive patterns. AhbHLH[STBX]63[STBZ] gene had the highest expression in flower, followed by stem and leaves, and the lowest in root. The highest expression level of AhbHLH[STBX]63 gene appeared at the mid-developmental stage during the development of peanut seed.

        Keywords Peanut (Arachis hypogaea L.); bHLH transcription factor; Gene cloning; Expression analysis

        bHLH(basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物,因含有bHLH結構域而得名。bHLH 結構域由大約50 ~ 60個氨基酸組成,N端約含10 ~ 15個氨基酸的堿性氨基酸區(qū),C端約含40個氨基酸左右的α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)(HLH區(qū))[1],N端的堿性氨基酸區(qū)有DNA識別位點及DNA結合位點;約50%的HLH 區(qū)含高度保守的 H5-E9-R13 序列(His5-Glu9-Arg13) ,此結構對 bHLH 與DNA 的結合不可或缺,且HLH區(qū)兩個相連的螺旋結構富含疏水氨基酸[2]。普遍認為bHLH轉(zhuǎn)錄因子以同源二聚體或異源二聚體的形式發(fā)揮功能[3],且其二聚體的特性由HLH 區(qū)內(nèi)的疏水氨基酸及帶電荷氨基酸殘基之間的相互作用決定[4]。bHLH眾多成員在調(diào)控植物生長發(fā)育的很多過程中都起著十分重要的作用[5],如光信號傳導、激素合成[6]、抗逆以及根毛發(fā)育[7,8]等。大量研究證實,植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子可與其他轉(zhuǎn)錄因子共同發(fā)揮功能,如bHLH類轉(zhuǎn)錄因子PIF3 和HFR1形成異源二聚體,進一步與光敏色素形成具有功能的三元復合體,調(diào)控植物生長萌發(fā)過程[9];bHLH1與MYB3轉(zhuǎn)錄因子相互作用協(xié)調(diào)調(diào)控類黃酮代謝途徑[10]。植物 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用時既可起轉(zhuǎn)錄激活作用也可起抑制作用。Heisler等[11]通過對基因功能缺失突變株的研究證實bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因SPATULA可以通過抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制種子的萌發(fā)。

        近年來的研究發(fā)現(xiàn),選擇性剪接(alternative splicing)在植物生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。擬南芥中61%具有內(nèi)含子的基因存在選擇性剪接[12];花生62%以上的脂肪酸合成與油脂積累相關基因存在選擇性剪接[13]。mRNA通過選擇性剪接可以增加轉(zhuǎn)錄本的多樣性和編碼蛋白的豐富度,從而精細調(diào)控許多生物學過程。

        本研究根據(jù)花生轉(zhuǎn)錄組測序結果,克隆了花生AhbHLH63基因,發(fā)現(xiàn)該基因存在兩種剪接方式。利用生物信息學詳細分析該基因及編碼的氨基酸序列,并利用qRT-PCR分析其在栽培種花生豐花1號不同組織及其不同發(fā)育時期的表達情況,以期為該基因的功能研究提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 植物材料

        花生品種豐花1號(由本實驗室保存),種植于山東省農(nóng)業(yè)科學院飲馬泉實驗基地。發(fā)育中的花生種子從果針入土開始計算,每間隔10 d取樣一次,取10 ~ 70 d的去種皮種子為樣品;采取盛開期的整朵花及出土后20 d的主根、主莖和幼嫩葉片為材料。取材后迅速凍存于液氮并于-80℃冰箱保存,用于RNA或DNA提取。

        1.2 菌株、質(zhì)粒和試劑

        大腸桿菌(Escherichia coli)T1感受態(tài)細胞、pEASY-T1克隆載體、2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix,購自北京全式金生物技術有限公司;熒光實時定量PCR檢測試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、限制性內(nèi)切酶,購于寶生物工程(大連)有限公司;凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DL2000分子量標準,購自 GENERAY 生物工程(上海)有限公司;TRIzol Reagent,購自賽默飛世爾科技公司(上海);植物總RNA提取試劑盒,購自北京華越洋生物科技有限公司;由上海生工生物工程技術服務有限公司合成擴增引物;DNA測序由山東省農(nóng)業(yè)科學院測序中心完成。

        1.3 AhbHLH63基因cDNA和基因組DNA(gDNA)的克隆

        以豐花1號幼嫩葉片為材料,選用CTAB法[14]提取DNA;利用華越洋(多糖多酚)試劑盒提取果針入土70 d的花生種子總 RNA。使用 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一條鏈,置于-20℃?zhèn)溆?。結合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用 Primer Premier 5.0 軟件設計引物,經(jīng)過 PCR檢測篩選最終引物(表1)。

        PCR反應體系包括HiFi Ⅱ/Ⅰ Mix 10 μL,cDNA/gDNA 1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL,加ddH2O補足至20 μL。反應程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s,56.5℃ 30 s,72℃ 2 min (gDNA為4 min),30個循環(huán);72℃ 7 min。瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物,GENERAY試劑盒回收目的片段,連接到克隆載體pEASY-T1上,轉(zhuǎn)化后,挑取陽性單克隆,進行酶切鑒定和序列測定。

        1.4 AhbHLH63基因的序列分析

        AhbHLH63蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點利用https://web.expasy.org/protparam/在線軟件分析;采用Expasy的在線工具ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)進行AhbHLH63蛋白的親疏水性分析;通過NCBI的CDD(Conserved Domain Database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)進行結構域預測;AhbHLH63蛋白的亞細胞定位利用Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/ ) 進行預測;通過DNAMAN軟件進行不同物種間氨基酸序列同源性分析,系統(tǒng)進化樹由MEGA 6.0軟件構建,采用Neighbor-Joining 法進行1 000次Boot-strap分析。

        1.5 AhbHLH63基因的表達模式分析

        以豐花1號花生的根、莖、葉、花和不同發(fā)育時期的種子為材料提取RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈;[JP2]以qRT-bHLH63-1.1F和qRT-bHLH63-1.1R及qRT-bHLH63-1.2F和qRT-bHLH63-1.2R為引物,以AhActin7為內(nèi)參基因(表 1),進行熒光定量 PCR擴增,反應體系采用 TransStart Green qPCR SuperMix UDG說明書中20 μL體系,[JP]每個樣品3個重復。采用ABI 7500 PCR儀器的兩步法進行,程序如下:95℃ 10 min;95℃ 10 s,退火及延伸60℃ 30 s,40個循環(huán)。ABI 7500自帶軟件自動生成PCR擴增曲線。采用2-ΔΔCt方法進行基因表達量的計算。

        2 結果與分析

        2.1 AhbHLH63基因cDNA和gDNA克隆

        [JP2]以提取的豐花1號果針入土70 d的種子第一鏈cDNA為模板,利用特異性引物AhbHLH63-orf F 1.1和AhbHLH63-orf[JP] R 1.1擴增到約12 kb的片段(圖1)。測序分析可知,所擴得的片段大小分別為1 219 bp和1 237 bp,分別命名為AhbHLH63-1.1和 AhbHLH63-1.2。

        以特異性引物AhbHLH63-gDNA F和AhbHLH63-gDNA R擴增AhbHLH63基因的gDNA 序列,得到一段約2 kb的產(chǎn)物(圖2)。測序結果顯示,片段大小為2 078 bp。

        2.2 AhbHLH63基因序列分析

        AhbHLH63基因的兩種cDNA序列AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2的ORF分別長1 188 bp和1 152 bp,分別編碼 395和383個氨基酸,理論相對分子量分別為41.69 kD和43.1 kD,等電點分別為8.07和7.07。

        對gDNA序列及結構進行分析,結果(圖3)顯示,該基因包含7個外顯子和6個內(nèi)含子。兩cDNA的差異是由第6個內(nèi)含子的選擇性剪接導致。AhbHLH63-1.1剪接體在轉(zhuǎn)錄后剪切掉了較大第6內(nèi)含子;而AhbHLH63-1.2則選擇性地剪切掉較小的內(nèi)含子,致使第6外顯子109 bp處引入1個終止密碼TAA提前終止了翻譯。

        2.3 AhbHLH63的生物信息學分析

        利用CDD分析AhbHLH63蛋白的保守結構域,結果顯示,AhbHLH63蛋白含有保守結構域bHLH,推測該蛋白是bHLH家族成員(圖 4)。

        利用Expasy在線軟件分析氨基酸組成,結果(表2)顯示,AhbHLH63基因兩剪接體編碼的蛋白氨基酸組成中Ser含量最高,其次為Ala,Pro、Asn及Leu所占比例較為接近,其余15種氨基酸含量均低于6%。AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2蛋白中疏水性氨基酸分別占43.4%、43.2%,親水性氨基酸分別占56.6%、56.8%。利用Expasy的ProtScale工具在線預測AhbHLH63的疏水性,結果表明AhbHLH63蛋白屬于不穩(wěn)定性蛋白,該蛋白存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū);在AhbHLH63保守結構域(約第200 ~ 270個氨基酸之間)的N端主要為堿性氨基酸,具有親水性,而保守結構域的C端兩個相連的螺旋結構則主要由疏水性氨基酸組成(圖5,以AhbHLH63-1.1蛋白為例)。Carretero-Paulet[15]等的研究發(fā)現(xiàn),α 螺旋-環(huán)-α螺旋結構多借助疏水氨基酸的作用形成二聚體,而疏水氨基酸與帶電氨基酸殘基之間的作用決定二聚體的特性,轉(zhuǎn)錄因子從而發(fā)揮其功能[4]。由此推測AhbHLH63蛋白的堿性氨基酸及疏水氨基酸區(qū)域可能與其功能有關。利用 Cell-PLoc 2.0在線軟件,預測AhbHLH63基因編碼的兩蛋白質(zhì)均位于細胞核。

        利用 DNAMAN 軟件對花生bHLH63的氨基酸與大豆、苜蓿、赤豆等19個物種相關序列進行同源性分析,并利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果(圖6)顯示, AhbHLH63蛋白與同屬蝶形花科的大豆、密花豆、狹葉羽扇豆、蒺藜苜蓿等物種的bHLH63蛋白親緣關系較近,聚為一簇;單子葉植物水稻、小麥、玉米等的同源蛋白聚為一簇。AhbHLH63與SsbHLH63(密花豆)、LaHBI1-like(狹葉羽扇豆)、MtbHLH63(蒺藜苜蓿)、VabHLH63(赤豆)和GmCIB1(大豆,cryptochrome interaction bHLH1)等序列一致性均達55%以上;與GrHBI1-like(棉花)序列一致性也接近50%;而與已知功能的AtCIB1(擬南芥)親緣關系相對較遠,序列相似性僅為39%。AhbHLH63的保守結構域序列與其他物種相關序列比對發(fā)現(xiàn),AhbHLH63蛋白與其他已知bHLH保守結構域僅存在個別氨基酸的差異(圖7);其中AhbHLH63序列的堿性氨基酸位于bHLH的N端,且含高度保守序列H5-E9-R13,進一步表明AhbHLH63屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子。

        2.4 AhbHLH63的基因表達分析

        以AhActin7作為內(nèi)參基因,對AhbHLH63基因在豐花1號根(R)、莖(St)、葉(L)、花(F)的表達模式進行qRT-PCR分析,以果針入土70 d的種子(70 d-S)中AhbHLH63基因表達量作為對照。結果顯示,花生不同組織中,AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2兩剪接體的表達模式較為一致,均為花中的表達量最高,其次是莖和葉,AhbHLH63-1.1在根中的表達量僅高于果針入土70 d的種子,AhbHLH63-1.2基因在根中表達量低于果針入土70 d的種子。不同組織中AhbHLH63-1.1表達量明顯高于AhbHLH63-1.2(圖8)。

        在不同發(fā)育時期的花生種子中,發(fā)育中期即果針入土30 ~ 50 d時AhbHLH63基因表達量明顯高于發(fā)育前期及后期。兩剪接體表達模式基本相同,果針入土10 d時AhbHLH-1.1表達量高于AhbHLH-1.2,但整體看來二者表達量均不高;果針入土20 d時,AhbHLH-1.2表達量略高于AhbHLH-1.1;果針入土30 d兩剪接體表達量均繼續(xù)明顯升高,且AhbHLH-1.1表達量重新高于AhbHLH-1.2;兩剪接體表達量達到峰值均在果針入土40 d時;果針入土50 d時AhbHLH-1.1基因表達量略微下降,而AhbHLH-1.2表達量下降顯著,表達水平與30 d時基本持平;此后基因表達量繼續(xù)逐步降低,且兩剪接體的相對表達量水平呈現(xiàn)維持一致的趨勢(圖9)。

        3 討論與結論

        bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為植物中僅次于 MYB 的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族[16],在植物生長發(fā)育的方方面面均起重要調(diào)控作用。本研究根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),[JP2]克隆得到花生bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因AhbHLH63的cDNA 序列,AhbHLH63蛋白含有螺旋-環(huán)-螺旋結構,屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族。對其理化性質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn),AhbHLH63蛋白包含明顯的疏水區(qū)和親水區(qū),其位于疏水區(qū)的螺旋-環(huán)-[JP]螺旋結構可能與其功能結構域相關。系統(tǒng)進化樹分析顯示,與AhbHLH63蛋白親緣關系較近的除了大豆、苜蓿、赤豆等植物的bHLH63蛋白外,還包括已知功能的狹葉羽扇豆、棉花的HBI1-like蛋白及大豆的CIB1蛋白等。研究發(fā)現(xiàn),CIB1參與擬南芥[17]、小麥[18]和大豆[19]等植物開花過程的調(diào)控。Liu等[20]的研究證實大豆中的CIB1蛋白與隱花色素蛋白CRY2a 相互作用能夠激活藍光依賴的葉衰老;CRY2與CIB1之間的相互作用還參與調(diào)控藍光依賴的開花起始及胚軸伸長過程。擬南芥中HBI1 基因是CIB1的同源基因,外源生長素能夠誘導HBI1在幼苗根中的表達[21],且擬南芥HBI1通過響應外源激素赤霉素、油菜素內(nèi)酯的信號,從而調(diào)控細胞伸長相關基因的表達[17,22]。此外,HBI1作為生長激素與免疫信號相互作用的關鍵節(jié)點,參與擬南芥的免疫調(diào)節(jié)[8]。本研究獲得的AhbHLH63轉(zhuǎn)錄因子具體參與調(diào)控植物生長發(fā)育的哪些過程,有待進一步研究。

        選擇性剪接是真核生物轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達的重要手段。有些基因通過可變剪接賦予不同剪接體不同的功能,有些則是多個剪接體共同促進某一功能的發(fā)揮[23]。DOG1(delay of germination 1)基因是種子休眠的重要調(diào)控因子,擬南芥種子的休眠性與不同生態(tài)型間DOG1表達水平的差異密切相關。DOG1通過選擇性剪接能產(chǎn)生5種剪接變體,共編碼3種蛋白異構體。盡管單個DOG1蛋白有功能,但該蛋白需要與自身或其他異構體結合防止自身降解。DOG1-β在種子發(fā)育過程中的積累量明顯高于其他異構體,而DOG1-δ在種子成熟期豐度相對增加。因此,選擇性剪接可能是精細調(diào)控DOG1蛋白積累的一種機制[24]。PP2C類磷酸酶基因HAB1的兩個剪接體HAB1.1和HAB1.2分別編碼全長蛋白和C端截短的蛋白,在ABA介導的種子萌發(fā)過程中起相反作用。HAB1.1負調(diào)控ABA信號途徑,而HAB1.2由于缺少催化結構域,喪失了磷酸酶活性,從而正調(diào)控ABA信號途徑。當ABA存在時,HAB1.2為主要異構體,HAB1.1與HAB1.2比例明顯下降,對下游SnRK2激酶活性的抑制作用減弱,進而防止種子萌發(fā)[25]。不同的細胞類型及生理狀態(tài)等可能會影響產(chǎn)生剪接體的方式以及不同剪接體之間的相互作用[26]。本研究克隆了花生AhbHLH63基因的兩個剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2,并分析了其在栽培品種豐花1號不同組織及不同發(fā)育時期種子中的表達情況,結果顯示AhbHLH63基因呈組成型表達模式,兩剪接體均在花中表達量最高,根中表達量較低;種子發(fā)育中期的表達量高于前期及后期。雖然此過程中剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2總體趨勢較為一致,但也略有差異。無論是不同組織還是不同發(fā)育時期種子中AhbHLH63-1.1的表達量整體高于AhbHLH63-1.2,推測是因為第6號內(nèi)含子的剪切方式不同導致AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2蛋白功能有所差異。AhbHLH63兩剪接體的具體功能及作用機制異同仍需進一步研究。深入研究相同基因中不同的剪接體,將有望進一步闡明植物內(nèi)含子的剪接機理及其調(diào)控基因表達的作用。

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        收稿日期:2019-08-24

        基金項目:山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目(CXGC2018E13)

        作者簡介:崔維佩(1996—),女,碩士研究生,研究方向為植物分子遺傳。

        通訊作者:單雷(1965—),女,研究員,研究方向為植物分子遺傳。E-mail: shlei1025@sina.com

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