崔維佩　谷朝陽　唐桂英　徐平麗　柳展基　單雷

摘要：bHLH轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中起著重要作用。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序結果從栽培種花生豐花1號中克隆得到AhbHLH63基因。序列分析顯示，AhbHLH63基因有兩個剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2，其ORF分別長1 188 bp和1 152 bp ，分別編碼395個氨基酸和383個氨基酸組成的蛋白。親緣關系分析表明，AhbHLH63蛋白含有一個預測的bHLH結構域，與其他植物的bHLH63具有較高的同源性，與苜蓿等的同源蛋白親緣關系較近。實時熒光定量PCR分析表明，AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2表達模式基本一致，均為組成型表達，在花中表達量最高，莖和葉中次之，在根中表達量最低;在花生種子的不同發(fā)育時期，發(fā)育中期表達量較高。

關鍵詞：花生;bHLH轉(zhuǎn)錄因子;基因克隆;表達分析

中圖分類號：S565.2：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0035-07

Cloning and Expression Analysis of [WTHX][STHX]AhbHLH63[WTHZ][STHZ] Gene in Peanut

Cui Weipei ， Gu Chaoyang1，3， Tang Guiying1， Xu Pingli1， Liu Zhanji4， Shan Lei1， 2， 3

（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/ Shandong Provincial Key Laboratory of

Crop Genetic Improvement Ecology and Physiology， Jinan 250100， China; 2. College of Life Science， Shandong Normal

University， Jinan 250014， China; 3. College of Life Sciences， Shandong University， Qingdao 266237， China;

4. Shandong Cotton Research Center， Jinan 250100， China）

Abstract bHLH transcription factors play the important roles in regulating plant growth and development. In this study， an AhbHLH[STBX]63 gene was cloned from cultivated peanut variety Fenghua 1 based on the results of transcriptomic sequencing. Sequence analysis showed that the AhbHLH[STBX]63 gene had two kinds of splicesome， AhbHLH[STBX]63-1.1 and AhbHLH[STBX]63-1.2[STBZ]， which had the open reading frame as 1 188 bp and 1 152 bp and encoded 395 and 383 amino acids respectively. Phylogenetic analysis indicated that the AhbHLH63 protein contained a predicted bHLH domain， which had high sequence identity with bHLH63 or homologous proteins from other plants， and had the highest similarity with that of alfalfa. Quantitative RT-PCR analysis showed that the expression profile of AhbHLH[STBX]63-1.1 was consistent with that of AhbHLH[STBX]63-1.2[STBZ]， which displayed the constitutive patterns. AhbHLH[STBX]63[STBZ] gene had the highest expression in flower， followed by stem and leaves， and the lowest in root. The highest expression level of AhbHLH[STBX]63 gene appeared at the mid-developmental stage during the development of peanut seed.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）; bHLH transcription factor; Gene cloning; Expression analysis

bHLH（basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物，因含有bHLH結構域而得名。bHLH 結構域由大約50 ～ 60個氨基酸組成，N端約含10 ～ 15個氨基酸的堿性氨基酸區(qū)，C端約含40個氨基酸左右的α-螺旋-環(huán)-α-螺旋區(qū)（HLH區(qū)）[1]，N端的堿性氨基酸區(qū)有DNA識別位點及DNA結合位點;約50%的HLH 區(qū)含高度保守的 H5-E9-R13 序列（His5-Glu9-Arg13） ，此結構對 bHLH 與DNA 的結合不可或缺，且HLH區(qū)兩個相連的螺旋結構富含疏水氨基酸[2]。普遍認為bHLH轉(zhuǎn)錄因子以同源二聚體或異源二聚體的形式發(fā)揮功能[3]，且其二聚體的特性由HLH 區(qū)內(nèi)的疏水氨基酸及帶電荷氨基酸殘基之間的相互作用決定[4]。bHLH眾多成員在調(diào)控植物生長發(fā)育的很多過程中都起著十分重要的作用[5]，如光信號傳導、激素合成[6]、抗逆以及根毛發(fā)育[7，8]等。大量研究證實，植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子可與其他轉(zhuǎn)錄因子共同發(fā)揮功能，如bHLH類轉(zhuǎn)錄因子PIF3 和HFR1形成異源二聚體，進一步與光敏色素形成具有功能的三元復合體，調(diào)控植物生長萌發(fā)過程[9];bHLH1與MYB3轉(zhuǎn)錄因子相互作用協(xié)調(diào)調(diào)控類黃酮代謝途徑[10]。植物 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用時既可起轉(zhuǎn)錄激活作用也可起抑制作用。Heisler等[11]通過對基因功能缺失突變株的研究證實bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因SPATULA可以通過抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制種子的萌發(fā)。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性剪接（alternative splicing）在植物生長發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。擬南芥中61%具有內(nèi)含子的基因存在選擇性剪接[12];花生62%以上的脂肪酸合成與油脂積累相關基因存在選擇性剪接[13]。mRNA通過選擇性剪接可以增加轉(zhuǎn)錄本的多樣性和編碼蛋白的豐富度，從而精細調(diào)控許多生物學過程。

本研究根據(jù)花生轉(zhuǎn)錄組測序結果，克隆了花生AhbHLH63基因，發(fā)現(xiàn)該基因存在兩種剪接方式。利用生物信息學詳細分析該基因及編碼的氨基酸序列，并利用qRT-PCR分析其在栽培種花生豐花1號不同組織及其不同發(fā)育時期的表達情況，以期為該基因的功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

花生品種豐花1號（由本實驗室保存），種植于山東省農(nóng)業(yè)科學院飲馬泉實驗基地。發(fā)育中的花生種子從果針入土開始計算，每間隔10 d取樣一次，取10 ～ 70 d的去種皮種子為樣品;采取盛開期的整朵花及出土后20 d的主根、主莖和幼嫩葉片為材料。取材后迅速凍存于液氮并于-80℃冰箱保存，用于RNA或DNA提取。

1.2 菌株、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）T1感受態(tài)細胞、pEASY-T1克隆載體、2×TransTaq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司;熒光實時定量PCR檢測試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、限制性內(nèi)切酶，購于寶生物工程（大連）有限公司;凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DL2000分子量標準，購自 GENERAY 生物工程（上海）有限公司;TRIzol Reagent，購自賽默飛世爾科技公司（上海）;植物總RNA提取試劑盒，購自北京華越洋生物科技有限公司;由上海生工生物工程技術服務有限公司合成擴增引物;DNA測序由山東省農(nóng)業(yè)科學院測序中心完成。

1.3 AhbHLH63基因cDNA和基因組DNA（gDNA）的克隆

以豐花1號幼嫩葉片為材料，選用CTAB法[14]提取DNA;利用華越洋（多糖多酚）試劑盒提取果針入土70 d的花生種子總 RNA。使用 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一條鏈，置于-20℃?zhèn)溆?。結合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用 Primer Premier 5.0 軟件設計引物，經(jīng)過 PCR檢測篩選最終引物（表1）。

PCR反應體系包括HiFi Ⅱ/Ⅰ Mix 10 μL，cDNA/gDNA 1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，加ddH2O補足至20 μL。反應程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，56.5℃ 30 s，72℃ 2 min （gDNA為4 min），30個循環(huán);72℃ 7 min。瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，GENERAY試劑盒回收目的片段，連接到克隆載體pEASY-T1上，轉(zhuǎn)化后，挑取陽性單克隆，進行酶切鑒定和序列測定。

1.4 AhbHLH63基因的序列分析

AhbHLH63蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點利用https：//web.expasy.org/protparam/在線軟件分析;采用Expasy的在線工具ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）進行AhbHLH63蛋白的親疏水性分析;通過NCBI的CDD（Conserved Domain Database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）進行結構域預測;AhbHLH63蛋白的亞細胞定位利用Cell-PLoc 2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/ ） 進行預測;通過DNAMAN軟件進行不同物種間氨基酸序列同源性分析，系統(tǒng)進化樹由MEGA 6.0軟件構建，采用Neighbor-Joining 法進行1 000次Boot-strap分析。

1.5 AhbHLH63基因的表達模式分析

以豐花1號花生的根、莖、葉、花和不同發(fā)育時期的種子為材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈;[JP2]以qRT-bHLH63-1.1F和qRT-bHLH63-1.1R及qRT-bHLH63-1.2F和qRT-bHLH63-1.2R為引物，以AhActin7為內(nèi)參基因（表 1），進行熒光定量 PCR擴增，反應體系采用 TransStart Green qPCR SuperMix UDG說明書中20 μL體系，[JP]每個樣品3個重復。采用ABI 7500 PCR儀器的兩步法進行，程序如下：95℃ 10 min;95℃ 10 s，退火及延伸60℃ 30 s，40個循環(huán)。ABI 7500自帶軟件自動生成PCR擴增曲線。采用2-ΔΔCt方法進行基因表達量的計算。

2 結果與分析

2.1 AhbHLH63基因cDNA和gDNA克隆

[JP2]以提取的豐花1號果針入土70 d的種子第一鏈cDNA為模板，利用特異性引物AhbHLH63-orf F 1.1和AhbHLH63-orf[JP] R 1.1擴增到約12 kb的片段（圖1）。測序分析可知，所擴得的片段大小分別為1 219 bp和1 237 bp，分別命名為AhbHLH63-1.1和 AhbHLH63-1.2。

以特異性引物AhbHLH63-gDNA F和AhbHLH63-gDNA R擴增AhbHLH63基因的gDNA 序列，得到一段約2 kb的產(chǎn)物（圖2）。測序結果顯示，片段大小為2 078 bp。

2.2 AhbHLH63基因序列分析

AhbHLH63基因的兩種cDNA序列AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2的ORF分別長1 188 bp和1 152 bp，分別編碼 395和383個氨基酸，理論相對分子量分別為41.69 kD和43.1 kD，等電點分別為8.07和7.07。

對gDNA序列及結構進行分析，結果（圖3）顯示，該基因包含7個外顯子和6個內(nèi)含子。兩cDNA的差異是由第6個內(nèi)含子的選擇性剪接導致。AhbHLH63-1.1剪接體在轉(zhuǎn)錄后剪切掉了較大第6內(nèi)含子;而AhbHLH63-1.2則選擇性地剪切掉較小的內(nèi)含子，致使第6外顯子109 bp處引入1個終止密碼TAA提前終止了翻譯。

2.3 AhbHLH63的生物信息學分析

利用CDD分析AhbHLH63蛋白的保守結構域，結果顯示，AhbHLH63蛋白含有保守結構域bHLH，推測該蛋白是bHLH家族成員（圖 4）。

利用Expasy在線軟件分析氨基酸組成，結果（表2）顯示，AhbHLH63基因兩剪接體編碼的蛋白氨基酸組成中Ser含量最高，其次為Ala，Pro、Asn及Leu所占比例較為接近，其余15種氨基酸含量均低于6%。AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2蛋白中疏水性氨基酸分別占43.4%、43.2%，親水性氨基酸分別占56.6%、56.8%。利用Expasy的ProtScale工具在線預測AhbHLH63的疏水性，結果表明AhbHLH63蛋白屬于不穩(wěn)定性蛋白，該蛋白存在明顯的疏水區(qū)和親水區(qū);在AhbHLH63保守結構域（約第200 ～ 270個氨基酸之間）的N端主要為堿性氨基酸，具有親水性，而保守結構域的C端兩個相連的螺旋結構則主要由疏水性氨基酸組成（圖5，以AhbHLH63-1.1蛋白為例）。Carretero-Paulet[15]等的研究發(fā)現(xiàn)，α 螺旋-環(huán)-α螺旋結構多借助疏水氨基酸的作用形成二聚體，而疏水氨基酸與帶電氨基酸殘基之間的作用決定二聚體的特性，轉(zhuǎn)錄因子從而發(fā)揮其功能[4]。由此推測AhbHLH63蛋白的堿性氨基酸及疏水氨基酸區(qū)域可能與其功能有關。利用 Cell-PLoc 2.0在線軟件，預測AhbHLH63基因編碼的兩蛋白質(zhì)均位于細胞核。

利用 DNAMAN 軟件對花生bHLH63的氨基酸與大豆、苜蓿、赤豆等19個物種相關序列進行同源性分析，并利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果（圖6）顯示， AhbHLH63蛋白與同屬蝶形花科的大豆、密花豆、狹葉羽扇豆、蒺藜苜蓿等物種的bHLH63蛋白親緣關系較近，聚為一簇;單子葉植物水稻、小麥、玉米等的同源蛋白聚為一簇。AhbHLH63與SsbHLH63（密花豆）、LaHBI1-like（狹葉羽扇豆）、MtbHLH63（蒺藜苜蓿）、VabHLH63（赤豆）和GmCIB1（大豆，cryptochrome interaction bHLH1）等序列一致性均達55%以上;與GrHBI1-like（棉花）序列一致性也接近50%;而與已知功能的AtCIB1（擬南芥）親緣關系相對較遠，序列相似性僅為39%。AhbHLH63的保守結構域序列與其他物種相關序列比對發(fā)現(xiàn)，AhbHLH63蛋白與其他已知bHLH保守結構域僅存在個別氨基酸的差異（圖7）;其中AhbHLH63序列的堿性氨基酸位于bHLH的N端，且含高度保守序列H5-E9-R13，進一步表明AhbHLH63屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子。

2.4 AhbHLH63的基因表達分析

以AhActin7作為內(nèi)參基因，對AhbHLH63基因在豐花1號根（R）、莖（St）、葉（L）、花（F）的表達模式進行qRT-PCR分析，以果針入土70 d的種子（70 d-S）中AhbHLH63基因表達量作為對照。結果顯示，花生不同組織中，AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2兩剪接體的表達模式較為一致，均為花中的表達量最高，其次是莖和葉，AhbHLH63-1.1在根中的表達量僅高于果針入土70 d的種子，AhbHLH63-1.2基因在根中表達量低于果針入土70 d的種子。不同組織中AhbHLH63-1.1表達量明顯高于AhbHLH63-1.2（圖8）。

在不同發(fā)育時期的花生種子中，發(fā)育中期即果針入土30 ～ 50 d時AhbHLH63基因表達量明顯高于發(fā)育前期及后期。兩剪接體表達模式基本相同，果針入土10 d時AhbHLH-1.1表達量高于AhbHLH-1.2，但整體看來二者表達量均不高;果針入土20 d時，AhbHLH-1.2表達量略高于AhbHLH-1.1;果針入土30 d兩剪接體表達量均繼續(xù)明顯升高，且AhbHLH-1.1表達量重新高于AhbHLH-1.2;兩剪接體表達量達到峰值均在果針入土40 d時;果針入土50 d時AhbHLH-1.1基因表達量略微下降，而AhbHLH-1.2表達量下降顯著，表達水平與30 d時基本持平;此后基因表達量繼續(xù)逐步降低，且兩剪接體的相對表達量水平呈現(xiàn)維持一致的趨勢（圖9）。

3 討論與結論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子作為植物中僅次于 MYB 的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族[16]，在植物生長發(fā)育的方方面面均起重要調(diào)控作用。本研究根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，[JP2]克隆得到花生bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因AhbHLH63的cDNA 序列，AhbHLH63蛋白含有螺旋-環(huán)-螺旋結構，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族。對其理化性質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)，AhbHLH63蛋白包含明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，其位于疏水區(qū)的螺旋-環(huán)-[JP]螺旋結構可能與其功能結構域相關。系統(tǒng)進化樹分析顯示，與AhbHLH63蛋白親緣關系較近的除了大豆、苜蓿、赤豆等植物的bHLH63蛋白外，還包括已知功能的狹葉羽扇豆、棉花的HBI1-like蛋白及大豆的CIB1蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)，CIB1參與擬南芥[17]、小麥[18]和大豆[19]等植物開花過程的調(diào)控。Liu等[20]的研究證實大豆中的CIB1蛋白與隱花色素蛋白CRY2a 相互作用能夠激活藍光依賴的葉衰老;CRY2與CIB1之間的相互作用還參與調(diào)控藍光依賴的開花起始及胚軸伸長過程。擬南芥中HBI1 基因是CIB1的同源基因，外源生長素能夠誘導HBI1在幼苗根中的表達[21]，且擬南芥HBI1通過響應外源激素赤霉素、油菜素內(nèi)酯的信號，從而調(diào)控細胞伸長相關基因的表達[17，22]。此外，HBI1作為生長激素與免疫信號相互作用的關鍵節(jié)點，參與擬南芥的免疫調(diào)節(jié)[8]。本研究獲得的AhbHLH63轉(zhuǎn)錄因子具體參與調(diào)控植物生長發(fā)育的哪些過程，有待進一步研究。

選擇性剪接是真核生物轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達的重要手段。有些基因通過可變剪接賦予不同剪接體不同的功能，有些則是多個剪接體共同促進某一功能的發(fā)揮[23]。DOG1（delay of germination 1）基因是種子休眠的重要調(diào)控因子，擬南芥種子的休眠性與不同生態(tài)型間DOG1表達水平的差異密切相關。DOG1通過選擇性剪接能產(chǎn)生5種剪接變體，共編碼3種蛋白異構體。盡管單個DOG1蛋白有功能，但該蛋白需要與自身或其他異構體結合防止自身降解。DOG1-β在種子發(fā)育過程中的積累量明顯高于其他異構體，而DOG1-δ在種子成熟期豐度相對增加。因此，選擇性剪接可能是精細調(diào)控DOG1蛋白積累的一種機制[24]。PP2C類磷酸酶基因HAB1的兩個剪接體HAB1.1和HAB1.2分別編碼全長蛋白和C端截短的蛋白，在ABA介導的種子萌發(fā)過程中起相反作用。HAB1.1負調(diào)控ABA信號途徑，而HAB1.2由于缺少催化結構域，喪失了磷酸酶活性，從而正調(diào)控ABA信號途徑。當ABA存在時，HAB1.2為主要異構體，HAB1.1與HAB1.2比例明顯下降，對下游SnRK2激酶活性的抑制作用減弱，進而防止種子萌發(fā)[25]。不同的細胞類型及生理狀態(tài)等可能會影響產(chǎn)生剪接體的方式以及不同剪接體之間的相互作用[26]。本研究克隆了花生AhbHLH63基因的兩個剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2，并分析了其在栽培品種豐花1號不同組織及不同發(fā)育時期種子中的表達情況，結果顯示AhbHLH63基因呈組成型表達模式，兩剪接體均在花中表達量最高，根中表達量較低;種子發(fā)育中期的表達量高于前期及后期。雖然此過程中剪接體AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2總體趨勢較為一致，但也略有差異。無論是不同組織還是不同發(fā)育時期種子中AhbHLH63-1.1的表達量整體高于AhbHLH63-1.2，推測是因為第6號內(nèi)含子的剪切方式不同導致AhbHLH63-1.1和AhbHLH63-1.2蛋白功能有所差異。AhbHLH63兩剪接體的具體功能及作用機制異同仍需進一步研究。深入研究相同基因中不同的剪接體，將有望進一步闡明植物內(nèi)含子的剪接機理及其調(diào)控基因表達的作用。

參 考 文 獻：

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收稿日期：2019-08-24

基金項目：山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2018E13）

作者簡介：崔維佩（1996—），女，碩士研究生，研究方向為植物分子遺傳。

通訊作者：單雷（1965—），女，研究員，研究方向為植物分子遺傳。E-mail： shlei1025@sina.com