耿曉進(jìn) 李海清 劉紫征

（1廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000；2河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心，河北廊坊065000；3河北省高校食藥用菌資源開發(fā)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北廊坊065000；4廊坊師范學(xué)院教育學(xué)院，河北廊坊065000）

食藥用菌是指具有肉質(zhì)、膠質(zhì)、膜質(zhì)、木質(zhì)、菌核等可供人類食用或藥用的真菌總稱[1]，因味道鮮美、營養(yǎng)價值高、生物活性物質(zhì)多而越來越受到人們關(guān)注。食藥用菌多糖作為其生物活性物質(zhì)的一種，主要存在于菌絲體、子實(shí)體或發(fā)酵液中，是一類由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然高分子化合物[2]。食藥用菌多糖有多種生物活性和生理功能，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗疲勞、抗輻射，預(yù)防和控制心血管疾病以及糖尿病等作用[3]，是一種極具開發(fā)價值的天然化合物，目前已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域，市場前景廣闊。因此食藥用菌多糖的提取也備受關(guān)注，而提取工藝和提取條件是食藥用菌多糖產(chǎn)量和品質(zhì)的重要保證。

筆者就目前常用的幾種食藥用菌多糖提取方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、適用條件以及取得的主要成果進(jìn)行總結(jié)，并對食藥用菌多糖提取條件優(yōu)化的兩種常用方法進(jìn)行了分析，旨在為食藥用菌多糖的工業(yè)生產(chǎn)和深加工提供參考。

1 食藥用菌多糖提取工藝

食藥用菌多糖提取的原料主要有子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液、菌核等[4]，最常用的是子實(shí)體和菌絲體。

1.1 熱水浸提法

純多糖含多個極性基團(tuán)（主要是羥基和其他極性取代基），水溶性較好，特別是在熱水中溶解度較高[5]。多糖溶液濃度較大時，通過加入極性有機(jī)溶劑（如乙醇）將其析出。熱水浸提法主要是利用外在熱力致使細(xì)胞膨脹，改變細(xì)胞壁內(nèi)外滲透壓，通過在時間和溫度上的累加效應(yīng)，使多糖從胞內(nèi)慢慢擴(kuò)散出來[6]，再通過醇沉獲取多糖。王晶等[7]用此方法，通過正交試驗(yàn)確定鱗柄小奧德蘑多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶40，提取時間1h，提取溫度90℃，提取次數(shù)3次，粗多糖得率約為8.84%，得到的粗多糖具有一定的抗氧化能力。鄭婷婷等[8]用熱水法提取黃皮疣柄牛肝菌多糖，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的提取條件為液料比34∶1，提取溫度51℃，提取時間3.1h，多糖的提取率為16.67%。

熱水浸提法是較為傳統(tǒng)的提取方法，提取條件溫和，對多糖活性破壞小，且設(shè)備簡單，操作容易，成本較低，較適合于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。但該方法提取時間長，醇用量較大，且多糖是熱敏性物質(zhì)，長時間在高溫下會影響其生物活性，在技術(shù)上并不十分完善[9]，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

1.2 堿浸提法

堿浸提法是通過堿液的作用，使食藥用菌細(xì)胞、細(xì)胞壁充分吸水膨脹而破裂，從而使多糖游離出來[10]，適合提取酸性或含有糖醛酸的多糖。黃越等[11]比較了熱水和堿液提取法提取猴頭菇粗多糖的提取效果，結(jié)果表明，堿液提取率高于熱水，得到的多糖體外抗氧化活性最大，說明堿液提取有利于得到較高生物活性的猴頭菇粗多糖提取物。紀(jì)欣童等[12]發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌堿溶多糖得率明顯高于水溶多糖，且堿提多糖的總還原力及羥基自由基清除率顯著高于水提多糖。顧菲菲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，堿提靈芝多糖主要是一種→3）Glc（β1→及→6）Glc（β1→連接的葡聚糖，而且堿提多糖組分展現(xiàn)出更好的免疫調(diào)節(jié)效果。

以上結(jié)果表明，堿浸提法能夠有效提高多糖得率和生物活性，多糖產(chǎn)量高。且該方法操作簡便，耗時短。但堿浸提法獲得的多糖純度不高，對設(shè)備的耐腐蝕性要求較高，耗能高[14]，廢棄堿液處理對環(huán)境有影響，且堿性過強(qiáng)，容易影響多糖的結(jié)構(gòu)從而影響多糖的性質(zhì)，所以對pH的優(yōu)化是堿浸提法提取多糖的瓶頸，有待深入研究。

1.3 酶法

酶能夠水解細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分的溶出，通常用到的酶有纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等。不同的酶對食藥用菌多糖得率影響不同。董麗輝等[15]分別用中性蛋白酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶、酸性蛋白酶提取亮菌多糖，在酶用量相同時，中性蛋白酶和纖維素酶對亮菌菌絲多糖的提取效果最顯著。

食藥用菌主要是半纖維素、蛋白質(zhì)及果膠等復(fù)雜的多糖共同結(jié)構(gòu)[16]，復(fù)合酶能夠同時破壞多個細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可使胞內(nèi)多糖更快、更徹底地釋放[17]，所以復(fù)合酶法提取率通常比單一酶法高，目前應(yīng)用較廣泛。如用復(fù)合酶法提取西藏金耳粗多糖的最佳酶解條件為酶質(zhì)量濃度6g/L、酶解時間3h、酶解溫度為45℃，此時多糖提取率達(dá)（11.59±0.10）%，比傳統(tǒng)的熱水浸提法（8.02%）提高了（43.26±1.25）%[18]。游金坤等[19]用水酶法提取金耳多糖的最佳工藝條件：復(fù)合酶添加量為20.50mg/g，液料比347∶1，提取溫度為52℃，提取時間52min，在此條件下金耳多糖的得率為（12.69±0.52）%。

以上研究結(jié)果表明，酶法提取能夠提高食藥用菌的多糖得率，大大縮短提取時間。且酶法提取條件溫和，對多糖損傷小，適合于提取不能經(jīng)歷熱激反應(yīng)的多糖。但酶法在提取多糖過程中會增加粗多糖中蛋白質(zhì)的含量，在后續(xù)操作中要進(jìn)行多糖的分離與純化，去除粗多糖中的蛋白質(zhì)。且酶易失活，不易保存，價格昂貴，在使用過程中更要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，并考慮經(jīng)濟(jì)效益。

1.4 超聲波法

超聲波具有由空化氣泡破裂產(chǎn)生的沖擊波和剪切力，超聲波提取技術(shù)就是利用超聲波的機(jī)械破碎、空化作用使細(xì)胞壁及整個生物體破裂，加速浸提物從原料向溶劑擴(kuò)散的一種提取技術(shù)[20]。超聲波設(shè)備較普遍，操作簡單，成本低，已廣泛應(yīng)用于食用菌多糖提取。CHEUNG等[21]利用超聲波輔助法從藥用真菌中提取多糖，結(jié)果表明超聲波輔助提取可顯著提高多糖得率并且不改變多糖分子結(jié)構(gòu)。CHEN等[22]分別采用水提取法、超聲提取法、微波提取法和酶解法四種方法提取松茸多糖，以多糖得率和抗氧化活性為指標(biāo)，結(jié)果表明超聲波提取法提取的多糖得率和抗氧化活性相對較高。

超聲波提取具有耗時短、溫度低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種高效的環(huán)境友好型提取技術(shù)。但在多糖提取過程中由于超聲波空化作用產(chǎn)生的高強(qiáng)度沖擊波和微射流破壞了細(xì)胞壁的完整性，因此對多糖的結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生了一定影響[23]。而且多糖的擴(kuò)散通常伴隨著它們在超聲波輔助提取過程中的降解，因此在應(yīng)用超聲波提取多糖時還要采取一些抑制多糖降解的措施。

1.5 微波法

微波法是通過微波來實(shí)現(xiàn)快速高效提取多糖的一種新技術(shù)。分子間的相互作用能產(chǎn)生大量的熱，這種熱量進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部之后，細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速上升，細(xì)胞壁承受不了細(xì)胞內(nèi)部的壓力，最終被破壞，使內(nèi)部物質(zhì)迅速自然地溶出。而物質(zhì)中的組分類型結(jié)構(gòu)不同，所需的微波能也不同，所以微波法不僅有快速高效提取的作用，還有和其他成分分離的作用。由于微波中的電磁場吸收電磁能，使物質(zhì)快速地升溫，大大縮減提取時間，與熱水浸提法相比，時間快幾倍甚至十幾倍。張海容等[24]通過微波萃取法提取香菇多糖，最佳工藝條件：微波功率40%、液固比為10∶1、加熱180s、pH1，與熱水浸提相比，提取率升高，還可將時間縮短100倍。

由于微波的加熱，直接萃取易引起多糖糖鏈的裂解，使其糊化[25]，且微波萃取要求溶劑必須有一定的極性，以吸收微波能進(jìn)行內(nèi)部加熱[26]，所以此方法更適用于極性溶劑的熱穩(wěn)定多糖提取。此外，微波功率和時間對多糖提取率都有較大的影響，在提取前需要對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 亞臨界水提取法

亞臨界水具有特殊的理化性質(zhì)，隨著水溫升高，水的介電常數(shù)降低，物質(zhì)在水中的溶解度及傳質(zhì)系數(shù)提高，從而提高了溶質(zhì)的擴(kuò)散速度[27]，溶解度增大，有利于多糖溶解，使提取率不斷上升。亞臨界水提取幾乎沒有能耗，其作用效果迅速、能量消耗較少；且亞臨界水會使蛋白質(zhì)、淀粉等變性，給后續(xù)的分離、純化帶來便利[28]。鄧辰辰等[29]通過單因素和正交試驗(yàn)，證明了亞臨界水提取靈芝多糖省時節(jié)能，效率和得率高。提取靈芝多糖的最佳工藝條件：提取溫度150℃，料液比為1∶12，提取時間5min，說明亞臨界水提取靈芝多糖是一種實(shí)用高效的提取方法。包怡紅等[30]用亞臨界水提取法提取木耳多糖，實(shí)際提取率達(dá)24.23%，與之前關(guān)于木耳多糖提取的研究相比，節(jié)能省時，且大幅度提高了提取率。

由于亞臨界水提取是以價廉、無污染的水作為提取劑，綠色環(huán)保，應(yīng)用前景廣闊，但仍存在諸多問題。首先，國內(nèi)亞臨界水萃取技術(shù)還處于起步階段，而國外的萃取裝置大多采用較短的萃取時間，較小的萃取釜，原料處理能力有限，僅適用于實(shí)驗(yàn)室研究，很難應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[31]。因此改進(jìn)萃取設(shè)備，使其適用于工業(yè)化生產(chǎn)是亟待解決的問題。其次，高溫高壓下可能會使熱敏性物質(zhì)的性質(zhì)或大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，雖然加入萃取改良劑能夠降低溫度，但改良劑加入過多會降低產(chǎn)物綠色環(huán)保的標(biāo)準(zhǔn)[32]，所以尋找更為環(huán)保的改良劑是該技術(shù)改進(jìn)的方向之一。為提高提取效率，將亞臨界提取技術(shù)與其他方法協(xié)同使用在國外已有相關(guān)報(bào)道，但仍有許多技術(shù)問題需要突破。

表1比較了幾種食藥用菌多糖提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)和使用條件。

在實(shí)際操作過程中，兩種甚至兩種以上提取方法的協(xié)同使用，發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢，能有效保存多糖生物活性，同時獲得更好的提取效果。近年來酶法結(jié)合超聲波法提取多糖得到廣泛應(yīng)用，因?yàn)槌暡ù龠M(jìn)底物與酶催化部位結(jié)合，同時促進(jìn)產(chǎn)物進(jìn)入介質(zhì)，提高酶催化活性。此外，超聲波空化作用產(chǎn)生的沖擊波能夠改變酶分子的構(gòu)象，使其更易與底物結(jié)合，從而提高催化效率[10]。陳小紅等[33]比較了單獨(dú)超聲提取與超聲輔助植物酶法提取茯苓多糖的效果，結(jié)果表明超聲輔助酶法能顯著提高多糖的浸出率和提取率（P＜0.05），其最大多糖浸出率、提取率分別為5.54%、4.72%，明顯地提高了水溶性茯苓多糖的提取效率。秦令祥等[34]采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取香菇多糖，可顯著提高香菇多糖提取率。微波、超聲波提取也是常用的協(xié)同方法，微波的熱效應(yīng)和對食藥用菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁的破壞力以及超聲波的空化效應(yīng)，能夠增大介質(zhì)的穿透力及分子運(yùn)動速度，增加胞內(nèi)物質(zhì)的溶出[35]。李三省等[36]將超聲和微波提取技術(shù)結(jié)合起來提取阿魏菇多糖，與傳統(tǒng)水浴浸提法相比，超聲-微波輔助提取縮短了提取時間，多糖得率由2.23%提高至5.6%，且該方法對阿魏菇多糖的結(jié)構(gòu)基本沒有影響。

2 食藥用菌多糖提取條件優(yōu)化

食藥用菌多糖提取效率不僅由提取方法決定，提取時間、溫度、次數(shù)、料液比、顆粒大小等提取因素也對其有很大的影響，因此對多因素進(jìn)行優(yōu)化就成了提高提取效率、保證多糖質(zhì)量的重要方法。目前對提取條件優(yōu)化的方法主要有正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法。

2.1 正交試驗(yàn)法

正交試驗(yàn)法是解決多因素、多水平試驗(yàn)問題的一種有效方法，它利用正交表安排試驗(yàn)，對試驗(yàn)方案作最優(yōu)設(shè)計(jì)[37]。

操作流程[38]：確定正交試驗(yàn)因素和水平→設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表→做正交試驗(yàn)、記錄試驗(yàn)結(jié)果→計(jì)算分析試驗(yàn)結(jié)果、選取最優(yōu)方案→驗(yàn)證試驗(yàn)、確定最佳方案。

表1 食藥用菌多糖不同提取方法比較

2.2 響應(yīng)面法

響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，通過對具有代表性的局部各點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，回歸擬合全局范圍內(nèi)因素與結(jié)果間的函數(shù)關(guān)系，并且取得各因素最優(yōu)水平值[39]。響應(yīng)面法能有效減少試驗(yàn)次數(shù)，并可考察影響因素之間的交互作用。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有多種，較為常用的有兩種[40]，一種是Box-BehnkenDesign（BBD），適用于2～5個因素的優(yōu)化試驗(yàn)，每個因素取3個水平；另一種是CentralCompositeDesign（CCD），其設(shè)計(jì)表是在兩水平析因設(shè)計(jì)的立方點(diǎn)基礎(chǔ)上加上軸向點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成的，每個因素取5個水平。

操作流程：確定響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平→設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)→構(gòu)建模型并檢驗(yàn)→做出響應(yīng)曲面和等高線→模型求解及驗(yàn)證→確定最佳方案。

正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法都能夠達(dá)到減少試驗(yàn)次數(shù)、縮短試驗(yàn)周期的目的，都是能夠有效解決多因素多水平試驗(yàn)問題、迅速找到優(yōu)化方案的科學(xué)計(jì)算方法。與正交試驗(yàn)法相比，響應(yīng)面法能夠給出直觀的響應(yīng)曲面圖，可以考察各因素水平間的交互作用；它不僅建立了預(yù)測模型，還對模型適應(yīng)性、模型和系數(shù)顯著性以及失擬項(xiàng)進(jìn)行檢驗(yàn)，進(jìn)一步進(jìn)行方差分析、模型診斷[40]。龍菊等[41]用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法分別優(yōu)化山藥多糖提取工藝，結(jié)果表明響應(yīng)面法在穩(wěn)定性和工作量方面更簡易、科學(xué)和合理。但在使用響應(yīng)面法優(yōu)化之前，應(yīng)當(dāng)確立合理的試驗(yàn)影響因素與水平，否則不能得到最佳的優(yōu)化結(jié)果。

3 討論

食藥用菌多糖具有廣闊的應(yīng)用價值和開發(fā)空間，目前已成為學(xué)術(shù)界研究熱點(diǎn)。多糖的提取方法雖然很多，但每種都有其優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)提取物的性質(zhì)，提取成本等選擇合適的工藝和設(shè)備，從而提高提取率，降低成本。提高食藥用菌多糖提取效率的關(guān)鍵在于細(xì)胞的破碎，酶降解、超聲波、微波處理都可輔助細(xì)胞破碎，同時優(yōu)化試驗(yàn)條件，能夠使多糖更易釋放溶解[42]。

近年來，超臨界流體萃取技術(shù)在生物活性物質(zhì)提取中得到廣泛應(yīng)用。目前最常用的超臨界流體溶劑是CO2。CO2的臨界溫度是常溫（31.06℃），且臨界密度比較大，臨界壓力適中；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，能防止萃取物被氧化；且在臨界點(diǎn)下與大部分物質(zhì)不相溶，易分離[43]。超臨界CO2流體萃取在食藥用菌多糖提取中主要用于對材料進(jìn)行脫脂預(yù)處理，用脫脂后的材料提取多糖可提高多糖得率。如以超臨界CO2流體萃取技術(shù)脫脂處理后的銀耳為原料提取多糖，比未脫脂的原料多糖提取率提高了2.65%[44]。利用超臨界CO2流體萃取技術(shù)對香菇脫脂，油脂萃取率為2.38%；以脫脂后的香菇進(jìn)行浸提提取多糖，總粗多糖提取率為6.57%，比傳統(tǒng)水浴浸提高3.53%，是傳統(tǒng)提取法的2.16倍，且產(chǎn)品的色澤和風(fēng)味更接近標(biāo)準(zhǔn)品[45]。該方法不但避免了化學(xué)試劑脫脂給原料及環(huán)境帶來污染，而且所得的副產(chǎn)物油脂還可作為功能性油脂進(jìn)行研究[46]，提高食藥用菌的綜合利用價值。隨著人們對食品藥品綠色安全的高要求，超臨界流體萃取技術(shù)有廣泛的應(yīng)用前景。但該技術(shù)裝置復(fù)雜，設(shè)備投資較大，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等問題還需要深入研究解決。