胡慧 弟豆豆 李裕旗 曹曉敏 姜中武,2 趙玲玲,2*

（1 煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺(tái)264005；2 山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺(tái)265500）

1 蘋(píng)果病毒病的研究概況

1933 年，Bradford 和Joley 首次發(fā)現(xiàn)了蘋(píng)果花葉病毒癥狀[1]。之后，蘋(píng)果病毒病開(kāi)始受到歐美一些國(guó)家研究人員的關(guān)注， 從20 世紀(jì)40 年代開(kāi)始專(zhuān)門(mén)對(duì)果樹(shù)病毒病進(jìn)行觀察、檢測(cè)和研究。我國(guó)蘋(píng)果病毒病的研究起步較晚，從20 世紀(jì)中期才開(kāi)始進(jìn)行相關(guān)研究。 直到60 年代初期，國(guó)內(nèi)研究人員才對(duì)蘋(píng)果花葉病和銹果病等蘋(píng)果病毒病的特點(diǎn)、傳播方法和防治技術(shù)進(jìn)行了初期的研究。1978年，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)一些病毒指示植物，真正開(kāi)展了蘋(píng)果病毒病研究。 到目前為止，全球已檢測(cè)出40 多種蘋(píng)果病毒， 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了幾種新的蘋(píng)果類(lèi)病毒，如蘋(píng)果凹果類(lèi)病毒(ADFVd)，該病毒在‘Starking delicious’ 蘋(píng)果上有明顯的凹果癥狀，其基因序列包含306 個(gè)核苷酸，在我國(guó)山東和新疆的蘋(píng)果樣品中檢測(cè)到該類(lèi)病毒。2015 年，我國(guó)研究學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)1 種雙生病毒(AGV)。 此外，還新發(fā)現(xiàn)一些病毒或類(lèi)病毒， 如蘋(píng)果錘頭狀類(lèi)病毒 （AHVD-likeRNA）、 蘋(píng)果壞死花葉病毒（APNMV）和蘋(píng)果腫枝病毒（AaLV）[2]等。

根據(jù)病毒在果樹(shù)體內(nèi)不斷繁殖，但沒(méi)有顯著癥狀的潛隱性特性，將病毒分為潛隱性病毒和非潛隱性病毒兩大類(lèi)。 我國(guó)共檢測(cè)出了19 種蘋(píng)果病毒，據(jù)我國(guó)技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的《蘋(píng)果無(wú)病毒母本樹(shù)和苗木檢疫規(guī)程》規(guī)定，如今鑒定出6 種蘋(píng)果病毒病：蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(ACLSV)、蘋(píng)果莖痘病毒(ASPV)、蘋(píng)果莖溝病毒(ASGV)、蘋(píng)果花葉病毒(ApMV)、蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒(ASSVd)和蘋(píng)果綠皺果病毒(AgrCV)，其中前3 種是潛隱性病毒，后3種是非潛隱性病毒。蘋(píng)果潛隱性病毒單獨(dú)或混合侵染樹(shù)體，混合侵染率較高，病毒侵染蘋(píng)果樹(shù)后，一般不表現(xiàn)典型癥狀，外觀上不易識(shí)別，但會(huì)影響嫁接親和性，而且混合侵染率高，造成樹(shù)勢(shì)衰弱、產(chǎn)量下降等問(wèn)題[3]。 蘋(píng)果非潛隱性病毒，通常在蘋(píng)果栽培品種上都能表現(xiàn)出典型的癥狀， 容易識(shí)別，對(duì)樹(shù)體危害很大。 如今在西北、東北、華北等各蘋(píng)果園區(qū)，都已檢測(cè)到非潛隱性病毒。

2 蘋(píng)果病毒病的發(fā)生原因和防治方法

2.1 發(fā)生原因

樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)不足或樹(shù)勢(shì)衰弱都會(huì)使樹(shù)體容易感染病毒，如施肥不合理，土壤沒(méi)有改良或通透性差，樹(shù)體負(fù)載量過(guò)大，留枝量過(guò)多等都會(huì)導(dǎo)致病毒的發(fā)生。此外，蘋(píng)果病毒還有很多傳播方式，如通過(guò)嫁接、接穗或砧木等傳播，也可通過(guò)人為傳播，因修剪工具接觸而傳染病毒，還可通過(guò)根系接觸或昆蟲(chóng)傳播。

2.2 防治方法

2.2.1 栽植無(wú)病毒苗木 栽植無(wú)病毒苗木是控制蘋(píng)果病毒病傳播、擴(kuò)散和危害的最實(shí)用有效的方法。 加強(qiáng)從脫毒技術(shù)到無(wú)病毒苗木原種，到母本園的建立，再到大量繁植無(wú)毒化苗木等一系列體系的執(zhí)行力度， 嚴(yán)禁從疫區(qū)調(diào)購(gòu)蘋(píng)果苗木，并嚴(yán)格按照市場(chǎng)蘋(píng)果苗木生產(chǎn)的要求，進(jìn)行無(wú)毒化栽培管理。

2.2.2 農(nóng)藝措施 可通過(guò)合理修剪樹(shù)體，消除大小年現(xiàn)象，調(diào)整果樹(shù)結(jié)構(gòu)，改善通風(fēng)透光條件等來(lái)增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)；并通過(guò)改良土壤性狀，加強(qiáng)果樹(shù)根系吸收，施用有機(jī)肥料等方法促進(jìn)蘋(píng)果樹(shù)健壯生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)感染病毒的衰弱樹(shù)和銹果病病樹(shù)后應(yīng)立即刨除，輪作2 年后更換新的無(wú)病毒果樹(shù)。 對(duì)有病毒的樹(shù)做特殊標(biāo)記，并且在修剪和疏花疏果時(shí)使用專(zhuān)門(mén)的修剪工具，避免和健壯的蘋(píng)果樹(shù)共用修剪工具，或者對(duì)修剪病樹(shù)后的工具進(jìn)行消毒處理，預(yù)防交叉感染，防止病毒傳播[4]。 在進(jìn)行嫁接和高接換種時(shí)，從健壯的果樹(shù)上取接穗或購(gòu)買(mǎi)高質(zhì)量的接穗，不在感染病毒的果樹(shù)上嫁接無(wú)病毒接穗或在健康的砧木上嫁接帶毒接穗。

2.2.3 藥劑防治 及時(shí)防治葉蟬等刺吸式害蟲(chóng)，防止病毒不斷擴(kuò)散， 應(yīng)盡量將蟲(chóng)害在為害前除掉。 用藥劑對(duì)土壤進(jìn)行消毒，采用全園噴施藥劑或剪鋸口涂藥劑， 可有效地預(yù)防蘋(píng)果樹(shù)感染病毒。藥劑可選擇鹽酸嗎啉胍、氯溴異氰尿酸、氨基寡糖素等。此外，還有一些抗病毒藥劑，比如病毒A、寧南霉素等，噴施這些藥劑后對(duì)病毒癥狀有減緩作用，可以交替輪流使用。

3 蘋(píng)果脫毒技術(shù)

推廣栽培無(wú)毒苗木是防治蘋(píng)果病毒病最有效的方法。 目前，蘋(píng)果脫毒技術(shù)主要包括熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒、莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理脫毒、化學(xué)脫毒、微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒和超低溫脫毒等。

3.1 熱處理脫毒

研究發(fā)現(xiàn)病毒和寄主細(xì)胞耐高溫能力有一定的差異，利用這一原理，熱處理脫毒時(shí)選擇利于寄主細(xì)胞生長(zhǎng)而不利于病毒的溫度，以此達(dá)到控制病毒擴(kuò)散的目的， 從而得到無(wú)病毒的新梢。現(xiàn)在常用的方法是將已經(jīng)感染病毒的植株置于35～38 ℃的熱空氣中，通過(guò)變溫及恒溫的方法對(duì)組培苗或盆栽苗進(jìn)行處理[5]。 變溫是指通過(guò)晝高夜低的控制方式，提高植株的存活率，一般高溫時(shí)間越長(zhǎng)，脫毒率越高。 熱處理脫毒的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單方便，缺點(diǎn)是耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，且不能徹底脫毒，尤其對(duì)一些耐熱性較強(qiáng)的病毒和耐熱性較差的植物來(lái)說(shuō)作用不大。

3.2 莖尖培養(yǎng)脫毒

莖尖培養(yǎng)脫毒的原理是病毒繁殖速度比分生組織細(xì)胞分裂速度慢，且病毒無(wú)法在分生組織擴(kuò)散，使病毒在植株內(nèi)分布不均勻，莖尖組織可能沒(méi)有感染病毒，以此來(lái)脫除病毒。 現(xiàn)有研究提出，莖尖無(wú)毒可能是因?yàn)椴《驹诰哂蟹稚芰Φ那o尖細(xì)胞中發(fā)生了RNA 沉默[6]。 并且指出莖尖大小與莖尖培養(yǎng)成活率成正比，與脫毒率及變異可能性成反比，莖尖太小，脫毒的再生率不高，而如果所取莖尖大于0.2 mm， 則不易徹底脫毒[7]。像ASGV 和ACLSV 等可以感染莖尖頂端的分生組織的病毒，目前僅用莖尖培養(yǎng)難以完全脫除。

3.3 莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理脫毒

由于熱處理對(duì)有些植物的脫毒效率低且不能完全脫毒，而莖尖培養(yǎng)的再生率不高，所以可將這兩種脫毒技術(shù)結(jié)合起來(lái)， 提高脫毒成功率。先把帶毒試管苗放在37 ℃的恒溫下處理28 d，切取下約0.5 mm 莖尖（包含1～3 片葉原基）進(jìn)行脫毒培養(yǎng)[8]。 莖尖培養(yǎng)結(jié)合熱處理有效提高莖尖的成活率和脫毒率，特別有利于僅用其中一種方法無(wú)法徹底脫毒的植物。

3.4 化學(xué)脫毒

化學(xué)脫毒主要是通過(guò)抑制病毒復(fù)制和誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性的方法來(lái)進(jìn)行脫毒?；瘜W(xué)藥劑有甘草酸和黃酮等天然抗病毒物質(zhì)，以及2，4-二羰基六氫-1，3，5-三嗪（DHT）和病毒醚等核酸類(lèi)似物物質(zhì)。常用的化學(xué)藥劑為病毒醚，研究發(fā)現(xiàn)，病毒醚的濃度大于40 mg/L，寄主會(huì)發(fā)生藥害，但這與品種和品種的基因也有關(guān)，部分品種當(dāng)病毒醚濃度大于或等于100 mg/L 時(shí)， 卻不發(fā)生藥害[9]。利用病毒醚脫毒已培養(yǎng)出多種無(wú)病毒蘋(píng)果苗木，值得注意的是操作過(guò)程中需要嚴(yán)格控制濃度。濃度太低，無(wú)法抑制病毒，太高，對(duì)苗木傷害大，甚至使植物變異， 而且植物不能產(chǎn)生病毒抗體，所以僅用病毒抑制劑不能徹底脫毒，通常要結(jié)合莖尖培養(yǎng)或熱處理脫毒。 研究發(fā)現(xiàn)，將其與莖尖培養(yǎng)或熱處理相結(jié)合，可脫除ASGV、ACLSV、ASPV等多種病毒。

3.5 微體嫁接離體培養(yǎng)脫毒

微體嫁接是指通過(guò)人工培養(yǎng)基栽培出實(shí)生苗的砧木，從無(wú)病毒苗木上取0.15～1.0 mm 的莖尖，然后在砧木的切斷面上通過(guò)試管微體嫁接得到無(wú)病毒的幼苗[10]。 在此之前，先高溫處理接穗一段時(shí)間，提高脫毒率。 微體嫁接砧木可直接用試管苗， 但是由于花粉和種子可能會(huì)傳播病毒，所以要先對(duì)砧木進(jìn)行脫毒。 影響微嫁接成活率因素包括接穗來(lái)源、莖尖大小和病毒種類(lèi)等。而莖尖大小與微嫁接的成活率成正比， 與其脫毒率成反比，所以，不易嫁接，且脫毒率和成活率不高，操作也不易完全掌握，實(shí)際應(yīng)用難度較大。

3.6 超低溫脫毒

超低溫脫毒是將組織培養(yǎng)與超低溫保存結(jié)合來(lái)進(jìn)行脫毒。 超低溫脫毒是一種新的脫毒方法，植物莖尖在經(jīng)過(guò)液氮處理后，帶病毒區(qū)域的細(xì)胞被殺死， 而沒(méi)有感染病毒的細(xì)胞成活再生[11]。 一般在超低溫環(huán)境條件下，絕大多數(shù)細(xì)胞的基本代謝和生長(zhǎng)都會(huì)停止， 在這種情況下，植物能在相對(duì)穩(wěn)定的生物學(xué)形態(tài)中比較完整的保存下來(lái)。存活下來(lái)的沒(méi)有感染病毒的頂端分生組織經(jīng)過(guò)再生培養(yǎng)出脫毒苗木。超低溫脫毒也可結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒，能快速脫毒，且耗時(shí)短，并且其遺傳基因穩(wěn)定，不需要特殊設(shè)備，是一種快速高效的脫毒方法。

4 問(wèn)題與展望

蘋(píng)果病毒病是系統(tǒng)侵染性病害，主要通過(guò)嫁接等無(wú)性繁殖方式傳播，果樹(shù)感染病毒后，病毒將始終在樹(shù)體內(nèi)繁殖和危害，破壞果樹(shù)的營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[12]。 目前全球還沒(méi)有完全有效的藥劑可以抑制病毒病的發(fā)生，病毒病危害愈加嚴(yán)重。 針對(duì)此現(xiàn)狀，應(yīng)大力繁育栽培無(wú)毒苗，推廣無(wú)毒化栽培管理技術(shù)。 但是由于果樹(shù)市場(chǎng)存在監(jiān)管不嚴(yán)、工作人員生產(chǎn)技術(shù)不合理等問(wèn)題，市場(chǎng)上真正可以投入到生產(chǎn)上的無(wú)毒苗不多， 因此我國(guó)急需規(guī)范統(tǒng)一蘋(píng)果無(wú)毒苗生產(chǎn)體系， 加強(qiáng)市場(chǎng)監(jiān)管， 重視蘋(píng)果病毒病的研究、 檢測(cè)和防控工作，嚴(yán)格檢疫，大范圍的推廣無(wú)毒苗木，通過(guò)源頭控制蘋(píng)果病毒病， 才能夠有效阻止病毒病的蔓延，從而提高蘋(píng)果的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展。