張文，廖靜，徐梓焓

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010）

黑米別名紫米，血米，自古以來就有“貢米”、“世界米中之王”之美稱，營養(yǎng)豐富，具備極高的食用價值和藥用價值。其中，蛋白質(zhì)的含量比一般大米含量高出20%以上，特別是8 種必需氨基酸含量，比常見谷類食物高出25%以上[1]。然而，盡管擁有如此多的先天優(yōu)勢，黑米酒所占市場份額卻較小，銷售量較低，市場份額遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如烈酒和啤酒行業(yè)[2-3]。

隨著最近這幾年國家政策的調(diào)整、消費者的變化再加上本身的不斷努力，黑米酒市場已經(jīng)展現(xiàn)出良好的發(fā)展前景[4-6]。消費人口增多且年輕化，同時隨著消費者的生活水平不斷提高，身體的健康和生活的質(zhì)量成為人們首要看重的事情，黑米酒作為一種擁有超高營養(yǎng)價值和藥用價值的低度酒，即將成為人們?nèi)粘ｏ嬀频淖罴堰x擇之一。

盡管目前的黑米酒占有市場比例較小，但前景廣闊，發(fā)展空間巨大。因此，本研究以黑米酒為研究對象，以酒精度、總糖度、氨基酸態(tài)氮含量和感官評價為多評價指標(biāo)，研究蒸煮時間、酒曲添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對黑米酒品質(zhì)的影響，并通過正交試驗和綜合平衡法得出最優(yōu)黑米酒制作工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑米：當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、甲醛、95%乙醇：均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀：均為分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

MS205DU 電子天平：瑞士 Mettler-Toledo 公司；雷磁phs-3c 臺式酸度計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HC-01 手持糖度計：杭州三永德儀器儀表有限公司；IH16E8-210 電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司；DZTW 300W 調(diào)溫電加熱套：力辰科技有限公司；BLUE PARD 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

揀選→淘洗→浸泡→蒸飯→冷卻→拌曲→糖化→加水→發(fā)酵→過濾→澄清→灌裝→成品。

揀選與淘洗：精選優(yōu)質(zhì)黑米，去除其中的雜質(zhì)、碎米和塵土顆粒，將黑米淘洗2 次～3 次。

浸泡：用40 ℃的水浸泡黑米，同時液位高于米面10 cm，浸泡48 h，收集浸泡水。收集浸泡水的目的是在蒸飯、凉飯和拌曲加水等工序時加入一定量的澄清浸泡水可補回部分黑色素，增加黑米酒的保健功能。

蒸飯：把浸泡瀝干后的黑米進(jìn)行蒸煮30 min～40 min。

冷卻：將置涼的凈化浸泡水或者涼白開從黑米飯上面淋下，使飯溫冷卻為28 ℃～30 ℃。淋米操作要迅速，不可將米飯暴露于空氣中太長時間，避免雜菌污染[7]。

拌曲、糖化：在已冷卻好的米飯中加入試驗設(shè)計所需量的甜酒曲，充分拌勻，在裝入已滅菌的容器中，30 ℃恒溫條件下糖化48 h。

加水：糖化后，用已滅菌的量筒向玻璃瓶中加入黑米重1.5 倍的蒸餾水。

發(fā)酵：根據(jù)試驗設(shè)計將分裝的黑米酒置于不同的溫度條件下放置發(fā)酵不同的時間。

灌裝：用已滅菌的4 層紗布將成品壓榨過濾，靜置一段時間使濾液澄清，灌裝入已滅菌的玻璃瓶中，再用保鮮膜密封住瓶口。

1.2.2 單因素試驗

以酒精度、總糖和氨基酸態(tài)氮含量為評價指標(biāo)，分別選擇蒸煮時間、酒曲添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4 個因素進(jìn)行單因素試驗。研究不同的蒸煮時間（29、32、35、38、41 min）、酒曲添加量（0.6 %、0.8 %、1.0%、1.2%、1.4%）、發(fā)酵時間（36、48、60、72、84 h）和發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）對黑米酒品質(zhì)的影響。

1.2.3 工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取合適的試驗因素和水平進(jìn)行正交試驗。以酒精度、總糖度、氨基酸態(tài)氮含量以及感官評價分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，通過極差分析法和綜合平衡法來分析所得數(shù)據(jù)，從而確定黑米酒釀造的最佳工藝參數(shù)[8-10]。本研究選擇酒曲添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為研究因素，按照L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗，正交試驗因素水平設(shè)計如表1 所示。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.2.4 黑米酒理化指標(biāo)檢測

對選取的各理化指標(biāo)檢測按照下列選取的方法進(jìn)行測定。酒精度的測定：GB 5009.225-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計法；總糖的測定：手持糖度計；氨基酸態(tài)氮測定：酸度計電位滴定法[11]。

1.2.5 黑米酒的感官評定

參考許明明等[12]和魏永義等[13]方法，評定小組由12 名成員組成，分別對黑米酒的外觀、香氣、口感三方面按照GB/T 13662-2018《黃酒》中的清爽型黃酒感官評價的要求和感官檢查的要求進(jìn)行感官評價。評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 黑米酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)表Table 2 Standards for black rice wine sensory evaluation

續(xù)表2 黑米酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)表Continue table 2 Standards for black rice wine sensory evaluation

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

蒸煮時間對黑米酒品質(zhì)的影響如圖1 所示。

圖1 蒸煮時間對黑米酒檢測指標(biāo)的影響Fig.1 Effect of steam time on detection indices of black rice wine

當(dāng)蒸煮時間較少時，酒樣的總糖度、酒精度和氨基酸態(tài)氮含量都較低。這是因為蒸煮時間短，黑米未熟透，糊化不徹底，從而導(dǎo)致糖化發(fā)酵比較困難，進(jìn)程緩慢，各指標(biāo)含量較低。隨著蒸煮時間的增加，米飯逐漸熟透，酒曲中的微生物可充分作用于糖類及其降解物，使得酒樣糖度、酒精度和氨基酸態(tài)氮含量隨之增加[14]。當(dāng)蒸煮時間超過32 min 時，黑米酒樣各指標(biāo)隨蒸煮時間的增加變化不大，說明蒸煮時間在32 min～40 min 內(nèi)，黑米酒品質(zhì)變化較小。

酒曲添加量對黑米酒品質(zhì)的影響如圖2 所示。

圖2 酒曲添加量對黑米酒檢測指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of yeast addition on detection indices of black rice wine

當(dāng)酒曲添加量為0.6%時，黑米酒樣中的總糖度、酒精度以及氨基酸態(tài)氮測量值都較低，此時的黑米酒甜度和酒味欠佳。這是由于當(dāng)酒曲添加量過少時，微生物含量較少，糖化發(fā)酵遲緩甚至困難。微生物活動性低，使得酒樣發(fā)酵體系溫度偏低，酒樣在發(fā)酵過程中容易感染雜菌，使米酒中混有怪味。隨著酒曲的投入量增加，酒樣中的總糖度、氨基酸態(tài)氮和酒精度值隨之增加，投曲量達(dá)到1%時，各指標(biāo)達(dá)到最高。當(dāng)投曲量超過1%時，隨著投曲量增加，酒樣各指標(biāo)測值隨之下降，黑米酒入口有苦澀感，口感明顯變糟。這是因為當(dāng)酒曲添加量過大時，酵母菌大量繁殖消耗掉大部分的發(fā)酵性糖，酒精發(fā)酵進(jìn)程變緩，發(fā)酵體系升溫迅速從而失去平衡。在發(fā)酵后期，大量酵母菌自溶產(chǎn)生酪醇，黑米酒酸度增加，苦澀味加重，刺激感強烈。因此，1%為較優(yōu)酒曲添加量。

發(fā)酵時間對黑米酒品質(zhì)的影響如圖3 所示。

圖3 發(fā)酵時間對黑米酒檢測指標(biāo)的影響Fig.3 Effect of fermentation time on detection indices of black rice wine

當(dāng)發(fā)酵時間為36 h 時，酒樣中的糖度為最大值，酒精度與氨基酸態(tài)氮為最小值。隨著發(fā)酵時間增加，總糖度逐漸下降，而酒精度和氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升。這是因為，當(dāng)發(fā)酵時間少時，酒樣正處于發(fā)酵前期，酒曲中的酵母正處于生長繁殖階段，發(fā)酵作用不徹底，發(fā)酵液中仍含有較高糖量。隨著發(fā)酵時間的增加，作為供給酵母菌生長繁殖的能量和發(fā)酵原料的糖不斷消耗而含量逐漸下降，酒精度和氨基酸態(tài)氮含量不斷上升。在發(fā)酵過程中部分乙醇轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?，蛋白質(zhì)在蛋白酶作用下被降解為多肽及氨基酸，使得酒樣酸度逐漸升高[15]，酒味刺激性變大，黑米酒口感下降。根據(jù)試驗結(jié)果，確定72 h 為較優(yōu)發(fā)酵時間。

發(fā)酵溫度對黑米酒品質(zhì)的影響如圖4 所示。

圖4 發(fā)酵溫度對黑米酒檢測指標(biāo)的影響曲線Fig.4 Effect of fermentation temperature on detection indices of black rice wine

當(dāng)黑米酒的發(fā)酵溫度為26 ℃時，酒樣中各項指標(biāo)都偏低。這是因為當(dāng)溫度較低時，酶活性較低，酵母菌生長繁殖緩慢，最終導(dǎo)致發(fā)酵不充分[16]。此時的黑米酒寡淡無味，口感不好。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時，溫度的升高使得糖化速度和酵母菌的生長繁殖速度加快，微生物代謝旺盛，發(fā)酵效率升高，使得酒樣中總糖度、氨基酸態(tài)氮和酒精度值明顯上升。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，酒精度、氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，而總糖含量開始下降，說明此時酒曲中的酵母菌利用糖進(jìn)行代謝發(fā)酵效率最高。然而當(dāng)發(fā)酵溫度大30 ℃并隨著溫度的升高，總糖、酒精度和氨基酸態(tài)氮含量持續(xù)下降。這是因為溫度過高，微生物生長繁殖過于旺盛，不僅造成酵母菌早衰，還易使雜菌生長，酒樣酸敗[17-18]。當(dāng)溫度升高到發(fā)酵的臨界溫度附近時，菌體的生長與代謝受到抑制，酵母菌生存困難，出現(xiàn)衰亡現(xiàn)象，使得發(fā)酵產(chǎn)酒階段難以進(jìn)行，酒精度大幅下降，余糖開始堆積，導(dǎo)致總糖的下降變緩，酒樣口感拙劣。根據(jù)試驗結(jié)果，確定較優(yōu)發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

單因素方差分析表明發(fā)酵時間、酒曲添加量和發(fā)酵溫度對黑米酒品質(zhì)影響顯著，因此選擇此3 個因素，按照L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗。正交試驗及結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

從表3 中得出，對于各個檢測指標(biāo)得出的最佳方案各不相同，所以需要對各指標(biāo)進(jìn)行極差分析和綜合平衡來確定最佳方案。由極差分析可得對總糖度、氨基酸態(tài)氮、酒精度和感官評價的最優(yōu)工藝組合分別為A1C1B1、A2B2C2、A3B2C3和 A3B3C3。不同檢測指標(biāo)所選擇的最優(yōu)方案各不相同，選擇綜合平衡法對各指標(biāo)所得的最優(yōu)組合通過各因素的主次順序、水平優(yōu)劣進(jìn)行綜合平衡，從而確定整體的最優(yōu)方案。

因素A 在總糖度中是最主要的因素，在感官評價和酒精度這兩個指標(biāo)中是最次要因素，因此根據(jù)總糖度確定最優(yōu)水平。在總糖度指標(biāo)中，第一水平為最佳，因此選取A1為最佳水平，即酒曲添加量0.8%。因素B在酒精度和感官評價這兩個指標(biāo)中是第二主要的因素，分別選取的B2、B3，在總糖度和氨基酸態(tài)氮這兩個指標(biāo)中是次要因素，分別選取的是B1、B2。對于感官評價指標(biāo)來說，B3、B2影響程度接近，所以根據(jù)多數(shù)傾向，選取B2為最佳水平，即發(fā)酵溫度30 ℃。因素C 在氨基酸態(tài)氮、酒精度和感官評價3 個指標(biāo)中是最主要的因素，分別選取的C2、C3、C3。對于氨基酸態(tài)氮指標(biāo)來說，C2、C3影響程度接近，因此綜合分析可得選取C3為最佳水平，即發(fā)酵時間為84 h。綜上所述，黑米酒釀造工藝最優(yōu)方案為A1B2C3，即酒曲添加量為0.8%、發(fā)酵的溫度為30 ℃、發(fā)酵的時間為84 h。

2.3 最優(yōu)工藝的驗證及相關(guān)指標(biāo)檢測

按照正交試驗得到的最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行驗證試驗，此時黑米酒感官評價分?jǐn)?shù)為93 分，具有獨特的黑米米香和酒香；其色鮮紅均勻，富有光澤；酒體協(xié)調(diào)且余味綿長。檢測得到理化指標(biāo)如表4 所示，黑米酒各理化指標(biāo)符合GB/T 13662-2018《黃酒》中清爽型干黃酒理化要求。

表4 黑米酒理化指標(biāo)Table 4 Physicochemical indexes of black rice wine

3 結(jié)論

本研究探明了蒸煮時間、酒曲添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4 個因素對黑米酒品質(zhì)的影響并進(jìn)行了工藝組合優(yōu)化。研究結(jié)果表明：酒曲添加量主要影響黑米酒的總糖含量，對氨基酸態(tài)氮含量也具有一定影響；發(fā)酵時間對黑米酒的氨基酸態(tài)氮、酒精度含量影響最大；發(fā)酵溫度對黑米酒的糖度、酒精度、氨基酸態(tài)氮和感官品評都有一定影響。通過正交試驗得到黑米酒釀造工藝優(yōu)化最佳方案為酒曲添加量0.8%、發(fā)酵的為溫度30 ℃和發(fā)酵的時間為84 h。在此釀造條件下釀造的黑米酒各檢測值較優(yōu)，感官評價最好。此時的黑米酒呈現(xiàn)的紫紅色均勻，散發(fā)的酒香中帶有黑米特有的米香，甜度與酒精度協(xié)調(diào)，入口清醇綿長，有良好的后勁。