孟君，董夢娜，張峻松，徐清萍

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450001）

硒是機(jī)體生命活動不可缺少的一種微量元素，硒是人體所必需的微量元素之一，對人體健康具有非常重要的作用，被稱為“生命奇效元素”[1-2]。具有抗癌、抗氧化、抗衰老等多種生理功能，與許多種疾病密切相關(guān)[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，威脅人類健康的四十多種疾病都與人體缺硒有關(guān)，如克山病、大骨節(jié)病等。世界衛(wèi)生組織公布的資料表明，全球有40 多個國家屬于低硒或缺硒地區(qū)。中國是國際公認(rèn)的“缺硒大國”之一[4]。長期以來，我國的部分缺硒地區(qū)，通過在食物中添加無機(jī)的亞硒酸鈉。無機(jī)硒在體內(nèi)的生物利用率較低，且具有一定的毒性，若通過一定的轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)硒，就能克無機(jī)態(tài)硒的弊端[5]。Finley 等[6]的研究也表明，進(jìn)食生物硒是最有效安全的補(bǔ)硒方式。GB14880-1994《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》發(fā)布了準(zhǔn)許在食品中添加硒化合物作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑的規(guī)定。在這種形勢下，生物富硒成為研究的熱點[7]。通過植物種子發(fā)芽轉(zhuǎn)化法，利用蔬菜富集富硒培養(yǎng)液中的硒元素，將無機(jī)硒有機(jī)化，是一種安全有效的富硒食品制備方法[8-9]。本研究選擇黃豆、綠豆為材料，研究兩種豆在浸泡和萌發(fā)的過程中對硒富集情況，以期為人們提供廉價而有效的補(bǔ)硒途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

黃豆（Giycine max（L）Merrill）：永城農(nóng)家自產(chǎn)；綠豆（Vigna radiate）：河南鄭州農(nóng)貿(mào)市場。

亞硒酸鈉（分析純）：上海泰瑞爾化學(xué)有限公司；鹽酸（分析純）、硝酸（優(yōu)級純）、高氯酸（優(yōu)級純）：煙臺市雙雙化工有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硼氫化鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 g/L）：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

精密電子天平（MP200A）：上海良豐儀器儀表有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9145A）：海恒科技有限公司；凱氏消化爐（HYP-308）：上海纖檢儀器有限公司；原子熒光光度計（雙通道）：北京海光儀器公司。

1.2 儀器工作條件

原子熒光光譜儀工作參數(shù)的選擇，見表1。

1.3 方法

1.3.1 富硒豆芽的生產(chǎn)工藝

挑選色澤光亮、籽粒飽滿，無蛀蟲和無霉?fàn)€的黃豆和綠豆作為種豆，用50 ℃熱水浸泡30 min，將水瀝干，轉(zhuǎn)移到干凈的燒杯中。于室溫條件下（25 ℃），向燒杯中加入30 mL 一定濃度的亞硒酸鈉溶液，浸泡過夜（約12 h），取出瀝干，置于鋪有4 層紗布的育苗盤中，上部覆蓋4 層濕紗布，每12 h 噴淋10 mL 一定濃度亞硒酸鈉溶液，定期收獲豆芽，并記錄豆芽的生長情況，同時，做無富硒豆芽對照試驗。

表1 原子熒光分析條件Table 1 Working conditions of Atomic fluorescence spectrum

1.3.2 試驗設(shè)計

根據(jù)常規(guī)豆芽培養(yǎng)條件，選擇亞硒酸鈉濃度、富硒方式、培養(yǎng)時間3 個因素來探討黃豆和綠豆萌發(fā)的過程中對硒的吸收和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)富硒豆芽。通過單因素試驗，對富硒溶液中硒濃度（A）、培養(yǎng)時間（B）和富硒方式（C）這3 個因素進(jìn)行水平優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上設(shè)計L9（34）正交表，通過正交試驗對富硒豆芽的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化出最佳的富硒豆芽的生產(chǎn)條件。

1.3.3 硒的測定

1.3.3.1 樣品制備

分別取各個條件下培養(yǎng)的的富硒豆芽樣品，去掉種皮，用去離子水反復(fù)漂洗以除去表面所附著的硒，置于60 ℃烘箱中烘干（約6 h），將其粉碎，過60 目篩，稱取富硒豆芽干粉約0.15 g 于消化管中，加入15 mL硝酸-高氯酸（體積比為4 ∶1），置于濕法消解的凱氏消化瓶中進(jìn)行消解，當(dāng)溶液變澄清并有大量白煙冒出時，繼續(xù)加熱至剩余溶液約為5 mL（約80 min，切記不可蒸干）。待溶液冷卻后，滴加5 mL 鹽酸溶液（去離子水與鹽酸體積比為1 ∶1），繼續(xù)加熱至溶液變清并伴有白煙（約30 min），使六價的硒還原成四價。冷卻后，將消化液完全轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用去離子水定容。同時做試劑空白，放入4 ℃冰箱中，待測。

1.3.3.2 硒含量的測定

采用氫化物原子熒光分光光度計測定樣品中的硒，由于硒元素存在不同價態(tài)，Ⅳ價態(tài)硒易產(chǎn)生氫化物，在測定前需將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中的硒還原為四價，提高氫化物的產(chǎn)生效率。在儀器最佳工作條件下（表1），通過測定樣品溶液中硒元素的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而得樣品中待測元素的含量。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

硼氫化鉀溶液（15 g/L）：稱取2 g 氫氧化鈉溶于100 mL 去離子水中，加入15 g 硼氫化鉀，溶解后，再加入900 mL 去離子水，搖勻（現(xiàn)配）；鹽酸溶液（載液）：5 %；硒標(biāo)準(zhǔn)使用液（100 μg/L）：用移液管吸取硒單元素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1 g/L），稀釋到濃度為100 μg/L，以20%鹽酸溶液為介質(zhì)，用去離子水采用逐級稀釋配制系列硒標(biāo)準(zhǔn)溶液：2、4、6、8、10 μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 硒濃度對兩種豆芽生長狀況影響及豆芽硒的富集

選定的不同濃度的硒溶液系列，培養(yǎng)的兩種豆芽，待培養(yǎng)一定時間后，收取豆芽樣品，在表1 選定的最佳測定條件下，測定各個樣品中富集的硒含量，如圖1 所示。

圖1 黃、綠豆芽對不同濃度的硒溶液富集情況Fig.1 The Se content of mungbean and soybean in different Se concentration solutions

從圖1 可以看出，隨硒濃度的增大，兩種豆芽中的含硒量也增大，但是，培養(yǎng)的過程中硒濃度過高，豆芽的生長受到抑制。在此系列濃度條件下兩種豆芽的狀況見表2。

表2 不同濃度硒培養(yǎng)下綠豆和大豆的發(fā)芽情況Table 2 The germination status of mung bean and soybean in different Se concentration solutions

由圖1 及表2 可知，隨著富硒溶液中硒濃度增大，黃、綠豆芽中的含硒量也隨之增加，但發(fā)芽率隨之降低，芽苗生長受到抑制。

當(dāng)硒濃度達(dá)到10 μg/mL 時，黃豆芽出現(xiàn)腐蝕現(xiàn)象，隨著濃度不斷增大，黃豆芽生長受抑制程度越大，且豆芽萌發(fā)也受到較大影響，因此選擇6 μg/mL 作為富硒黃豆芽的最佳硒濃度。

隨著硒濃度增大，綠豆芽生長狀況良好，芽苗長度略微變短。當(dāng)硒濃度達(dá)到14 μg/mL 時，綠豆芽芽長適宜，繼續(xù)增大硒濃度，當(dāng)硒濃度達(dá)到18 μg/mL 時，芽長明顯變短，當(dāng)硒濃度達(dá)到22 μg/mL 時，綠豆芽部分被腐蝕，芽苗生長明顯受抑制。綜合情況選擇14 μg/mL作為富硒綠豆芽的最佳硒濃度。

2.1.2 培養(yǎng)時間對兩種豆芽生長狀況及含硒量的影響

以硒濃度為15 μg/mL 為富硒溶液進(jìn)行培養(yǎng)，不同的培養(yǎng)時間下，豆芽樣品中硒富集情況，見圖2。

圖2 培養(yǎng)時間對黃、綠豆芽硒含量影響Fig.2 The Se content of mungbean and soybean indifferent times

從圖2 可以看出，隨著培養(yǎng)時間延長，黃豆芽的含硒量逐漸增大，綠豆芽培養(yǎng)4 d 時，硒含量的變化不大，基本區(qū)域穩(wěn)定。但兩種豆芽隨時間的增長，應(yīng)考慮到兩豆芽的生長情況，見表3。

表3 培養(yǎng)時間對黃、綠豆芽生長狀況的影響Table 3 The germination status of mung bean and soybean in different times

由圖2 及表3 可知，隨著培養(yǎng)時間延長，黃豆芽的硒含量增大，綠豆芽硒含量趨于穩(wěn)定。且綠豆芽的生長速度比黃豆芽快。隨著培養(yǎng)時間延長，黃豆芽的芽長增長，發(fā)芽率降低，且腐蝕程度增大。綜合考慮，選擇5 d 作為黃豆芽的最佳培養(yǎng)時間。當(dāng)培養(yǎng)時間為4 d時，綠豆芽的硒含量及芽長趨于穩(wěn)定，延長培養(yǎng)時間，綠豆芽頭部發(fā)紅。因此，選擇4 d 作為綠豆芽的最佳培養(yǎng)時間。

2.1.3 富硒方式對兩種豆芽生長狀況及含硒量的影響以硒濃度為15 μg/mL，培養(yǎng)時間為5 d，選擇亞硒酸鈉浸泡-自來水噴灑，自來水浸泡-亞硒酸鈉噴灑，亞硒酸鈉浸泡-亞硒酸鈉噴灑，3 種不同的富硒形式，試驗結(jié)果見表4。

表4 富硒方式對黃、綠豆芽含硒量的影響Table 4 The Se content of mung bean and soybean in different Selenium-rich way μg/g

由表4 可以看出，3 種富硒方式中，以亞硒酸鈉浸泡-亞硒酸鈉噴灑這種方式培養(yǎng)的兩種豆芽樣品中的含硒量都較高。

2.2 正交試驗

2.2.1 黃豆芽正交試驗結(jié)果

通過單因素試驗結(jié)果，確定合適的正交試驗條件，黃豆芽正交試驗因素水平設(shè)計，富硒濃度A：4、6、8 μg/mL；培養(yǎng)時間 B：4、5、6 d；富硒方式 C：噴淋：浸種、浸種+噴淋。以硒含量作為試驗指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗分析，正交試驗結(jié)果見表5。

表5 黃豆芽正交表L9（34）及試驗數(shù)據(jù)Table 5 Orthogonal table L9（34）and the experimental data of soybean

續(xù)表5 黃豆芽正交表L9（34）及試驗數(shù)據(jù)Continue table 5 Orthogonal table L9（34）and the experimental data of soybean

據(jù)極差Rj 的大小可知，影響黃豆硒含量指標(biāo)的主次因素依次為：培養(yǎng)時間＞富硒溶液中硒濃度＞富硒方式。各因素水平的最優(yōu)組合為A2B2C1，而單因素最佳培養(yǎng)條件為A2B2C3，兩條件下樣品中的富硒差別不大，綜合考慮，選擇硒濃度為6 μg/mL，培養(yǎng)時間為5 d，富硒方式為亞硒酸鈉浸種+亞硒酸鈉噴灑作為富硒黃豆芽生長條件，在該條件下培養(yǎng)出的黃豆芽豆芽中硒含量最大，豆芽生長狀況良好，芽長適中。

2.2.2 綠豆芽的正交試驗結(jié)果

單因素試驗條件下，綠豆芽正交試驗因素水平設(shè)計：富硒濃度：14、16、18 μg/mL；培養(yǎng)時間：3、4、5 d；富硒方式：噴淋、浸種、噴淋+浸種，試驗結(jié)果見表6。

表6 綠豆正交表L9（34）及試驗數(shù)據(jù)Table 6 Orthogonal table L9（34）and the experimental data of mungbean

據(jù)極差R 的大小可知，影響黃豆硒含量指標(biāo)的主次因素依次為：富硒方式＞培養(yǎng)時間＞富硒溶液中硒濃度。根據(jù)表6 正交試驗優(yōu)化的結(jié)果各水平因素優(yōu)組合為A3B3C3，單因素試驗最佳條件為A2B2C3，在正交優(yōu)化的最佳條件下下進(jìn)行富硒培養(yǎng)，因豆芽長勢形態(tài)不佳，綜合考慮，選擇硒濃度為16 μg/mL，培養(yǎng)時間為4 d，富硒方式為亞硒酸鈉浸種-亞硒酸鈉噴灑，綠豆芽中硒含量最高，在該條件下培養(yǎng)出的綠豆芽生長狀況良好。

2.3 富硒組與對照組結(jié)果

通過上述正交試驗優(yōu)化出黃、綠豆芽各自富硒的最佳條件，在該條件下培養(yǎng)的富硒黃豆芽與綠豆芽，富硒豆芽與對各自對照組的硒含量，如表7 所示。

表7 富硒組與對照組樣品中的硒含量Table 7 The Se content of mungbean and soybean between Selenium group and control group

由表7 可以看出：在優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件下，富硒黃豆芽、綠豆芽中的實際的富硒量。從富硒率的大小可以看出，綠豆芽的較黃豆芽富硒能力強(qiáng)。

3 結(jié)論

本研究以黃豆、綠豆為原料，亞硒酸鈉溶液為硒源，培養(yǎng)富硒豆芽。以硒濃度、培養(yǎng)時間、富硒方式3 個因素進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化了富硒黃豆芽制備的最佳條件。在各自最佳生長條件下，比較綠豆、黃豆芽富硒組與對照組看出，綠豆、黃豆芽對硒具有較強(qiáng)的富集能力，綠豆比黃豆具有更強(qiáng)的富硒能力。試驗結(jié)果印證了植物體硒含量，不僅與栽種作物的生長環(huán)境中的硒含量密切相關(guān)，不同植物和不同品種對硒的富集吸收能力存在較大差異有關(guān)[10]。

通過豆發(fā)芽過程中對硒離子的富集作用，將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為人類可用的有機(jī)硒，能夠克服無機(jī)硒作為硒補(bǔ)充劑的劣勢。根據(jù)中國營養(yǎng)學(xué)會人膳食硒供給量50 μg/d～250 μg/d[11]。按照蔬菜含水量 96%計算，即日食用該黃豆芽200 g；綠豆芽的含水粗略也96%計算，每日食用綠豆芽150 g，食用該種富硒豆芽可滿足人體對硒的安全需求。為人們提供了較好的補(bǔ)硒途徑，該研究對有富硒產(chǎn)品的研究，特別是富硒蔬菜的開發(fā)與研究具有一定的借鑒意義。