王楷宬 ，王素春，樊擎瑩，孫亞偉，康京麗，汪 洋，劉華雷，黃保續(xù)

（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471023）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生和養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的傳染病之一。AIV屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬成員，由于其病毒基因組為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，故極易發(fā)生變異[1]。根據(jù)AIV 的致病性可將其分為低致病性禽流感病毒（low pathogenic avian influenza virus，LPAIV）、高致病性禽流感病毒（high pathogenic avian influenza virus，HPAIV）和非致病性禽流感病毒（non-pathogenic avian influenza virus，NPAIV）。以H5和H7亞型為代表的HPAIV 不僅嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，也嚴(yán)重威脅到了人類健康，因而得到了極大關(guān)注[2-4]。以H9亞型為代表的LPAIV 引起的癥狀相對(duì)輕微且死亡率低，因而未能引起足夠重視，以至于H9亞型成為當(dāng)前我國禽流感的主要流行型[5-6]。H9亞型AIV 在世界范圍內(nèi)廣泛分布，在遺傳進(jìn)化上，可以分為北美系和歐亞系兩大分支，其中歐亞系又進(jìn)一步衍生出以BJ/94-like 或Y280-like、G1-like、Y439-like 以及F/98-like 等為代表的病毒亞群。根據(jù)新的亞系命名系統(tǒng)，我國H9亞型AIV 分離毒株主要來源于H9.4.2分支，其中4.2分支又演化為4.2.1～4.2.6分支。近年來，我國分離的H9亞型AIV 毒株主要為H9.4.2.5分支[7]。

研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV 可由禽類跨種傳播給其他哺乳動(dòng)物，甚至是人類。葛菲菲等[10]報(bào)道，H9N2亞型AIV 在家禽中短期傳播后，可突變成高致病性病毒。研究[11]顯示，2013年在我國華東地區(qū)出現(xiàn)的H7N9亞型流感病毒中有部分基因片段來自H9N2亞型AIV。隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的飛速發(fā)展，在規(guī)?；B(yǎng)殖、活禽流通交易以及免疫壓力之下，H9亞型AIV 勢(shì)必威脅到公共衛(wèi)生安全以及養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展。H9亞型AIV 感染臨床上主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，與其他呼吸系統(tǒng)疾病難以區(qū)分，更值得關(guān)注的是H9亞型AIV 可引起免疫抑制，故臨床上常表現(xiàn)為H9亞型AIV 和其他病原的混合感染[12]。

為滿足快速準(zhǔn)確特異性檢測(cè)H9亞型AIV 的需求，本研究建立了針對(duì)H9亞型AIV 的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測(cè)方法，評(píng)估了該方法的靈敏度和特異性，并將該方法應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、Primescript One step RT-PCR Kit Ver.2：寶生物工程（大連）有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 核酸提取試劑盒：德 國QIAGEN 公 司；Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip：BIO-RAD；Optically clear flat 8 Cap Strips：Thermo Scientific。異丙醇、無水乙醇、RNaseA 等，均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

Qubit 核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑：購自Life Technologies 公司；超凈工作臺(tái)：美國Forma Scientific 公司；移液器：Eppendorf；孵化器：德州誠信孵化設(shè)備有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)：德國Heraeus Biofuge primoR；熒光定量PCR 儀：Bio-Rad CFX96 Real-time PCR System。

1.2 毒株與核酸提取

各亞型甲型流感病毒、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）等毒株，均由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室保存，毒株詳細(xì)信息見表1。按照說明書操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取病毒RNA，并使用Qubit 核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑測(cè)定RNA 濃度。

1.3 引物與探針篩選

參照NCBI GenBank 上發(fā)表的H9亞型AIV的血凝素（hemagglutinin，HA）基因序列，采用MEGA 6.0[13-14]進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取保守區(qū)域進(jìn)行熒光檢測(cè)引物和探針設(shè)計(jì)，并對(duì)多條引物、探針進(jìn)行組合、篩選與檢驗(yàn)，以篩選出最優(yōu)引物和探針。

表1 病毒毒株信息

1.4 反應(yīng)體系與條件

配制熒光定量RT-PCR 反應(yīng)液，每管25 μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL、5U/μL TaKaRa ExTaqHS 0.5 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，以 及10 pmol/μL H9 forward、H9 reverse 和H9 probe 各0.5 μL，RNase Free H2O 8.0 μL，待檢測(cè)樣品RNA 模板2 μL。將檢測(cè)反應(yīng)條件設(shè)置為：第1階段，42 ℃/5 min；第2階段，95 ℃/10 s；第3階段，95 ℃/5 s，60 ℃/20 s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)。無Ct 值并且無擴(kuò)增曲線，樣品判為陰性；Ct ≤36，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，樣品判為陽性。

1.5 特異性與靈敏度評(píng)估

采用上述反應(yīng)體系與反應(yīng)條件，檢測(cè)表1中的病毒RNA，以評(píng)估該檢測(cè)方法的特異性。提取的核酸經(jīng)Qubit 核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定RNA 濃度后，將此病毒RNA 稀釋為1 ng/μL，再依次10倍梯度稀釋為10-1～10-6ng/μL；分別取2 μL 作為反應(yīng)模板，按照前述加樣方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 核酸擴(kuò)增。

1.6 臨床樣品檢測(cè)

采集我國某市13個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的禽咽喉拭子共384份，置于含有10% 甘油和抗生素（含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 IU/mL、制霉菌素1 000 IU/mL、BSA 5 mg/mL）的PBS（pH7.2）緩沖液中，-80 ℃保存。將采集的樣品渦旋混勻后，4 ℃ 10 000 r/min 離心5 min；取上清，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen，德 國）提取病毒核酸，-80 ℃保存。使用96孔反應(yīng)管，加入上述反應(yīng)體系，再分別加入待檢樣品RNA 進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)用國家標(biāo)準(zhǔn)《H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR 檢測(cè)方法》（GB/T 19438.3—2004）中的熒光RT-PCR 檢測(cè)方法，對(duì)384份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，然后對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，分析本試驗(yàn)建立的方法在臨床檢測(cè)中的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針篩選

最終篩選出最適引物（H9 forward、H9 reverse）和探針（H9 probe），其中H9 probe 為TaqMan 熒光探針，標(biāo)記HEX 熒光（表2）。

表2 最適引物及探針序列

2.2 特異性與靈敏度

結(jié)果顯示，除H9亞型AIV RNA 模板對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組出現(xiàn)了正常熒光檢測(cè)曲線外，其他非特異性病毒的試驗(yàn)組及陰性對(duì)照組均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明，此方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)AIV 的特異性檢測(cè)，與其他相關(guān)病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)（圖1）。本研究篩選的引物和探針組合能夠保證檢測(cè)時(shí)的靈敏性，檢測(cè)靈敏度為RNA 終濃度10-4ng/μL（1.30×104copies/μL）。靈敏性試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖1 H9亞型AIV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 H9亞型AIV 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 臨床樣品檢測(cè)

用本研究建立的方法檢出66份樣品在CY5通道中有熒光信號(hào)，判定此66份樣品為H9亞型AIV 陽性，與國標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)到100%，表明本試驗(yàn)篩選的引物和探針通過熒光RT-PCR 方法檢測(cè)H9亞型AIV 準(zhǔn)確可信度高，可用于臨床樣品檢測(cè)。

3 討論

目前針對(duì)H9亞型AIV 的分子生物學(xué)檢測(cè)方法有反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和熒光RT-PCR 技術(shù)等[15]。實(shí)時(shí)熒光PCR 是在PCR 定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光PCR 可以分為SYBR-Green 熒光染料法和TaqMan 探針法。相比熒光染料法，探針法特異性強(qiáng)、靈敏度高，數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確[16-17]。

據(jù)研究[18-19]，自我國1994年首次報(bào)道從雞群中分離到 H9亞型AIV 以來，絕大部分省份都有H9亞型AIV 的流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)研究[6，19-20]均顯示，H9亞型AIV 在我國長(zhǎng)期處于較高的流行態(tài)勢(shì)，感染率仍在增高。本研究檢測(cè)的臨床樣品H9亞型個(gè)體陽性率為13.75%，與其他調(diào)查報(bào)告基本相符，也表明了我國H9亞型AIV 感染率較高。

近年來，有關(guān)H9亞型AIV 混合感染的報(bào)道不斷增多。H9亞型AIV 既可與其他亞型禽流感病毒混合感染，又可以其他病毒或細(xì)菌混合感染[21]。例如，H9亞型AIV 與禽偏肺病毒、IBV、NDV、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等混合感染，使得臨床癥狀更加復(fù)雜，不易被確診[22-25]。此外，混合感染往往呈現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率。

隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的飛速發(fā)展，家禽養(yǎng)殖集約化程度大幅提高，活禽運(yùn)輸交易越發(fā)頻繁，導(dǎo)致AI 防控越發(fā)困難。在疫苗免疫壓力以及環(huán)境壓力下，H9亞型AIV 正逐漸發(fā)生變異。已有的研究[26-28]顯示，我國不同地區(qū)H9亞型AIV 分離株的編碼基因在遺傳進(jìn)化方面均發(fā)生了一定程度的變異，以至于現(xiàn)有疫苗不能提供充分的免疫保護(hù)。

H9N2亞型AIV 也參與了H7N9亞型病毒的重組，更有報(bào)道[11，29-30]稱，H9N2亞型AIV 已跨越種間屏障，可直接感染人。近些年來，國內(nèi)學(xué)者對(duì)我國不同地區(qū)H9亞型AIV 的HA 基因分子特征及遺傳進(jìn)化開展了相關(guān)研究[26，31-32]，均發(fā)現(xiàn)H9亞型AIV 呈現(xiàn)出了典型的人流感受體結(jié)合特征，只是目前尚未突破種間屏障，獲得感染哺乳動(dòng)物的能力，提示國內(nèi)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)H9亞型AIV 的防控。

綜上可見，H9亞型AIV 不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展，更是威脅人類健康的一大隱患。且我國的H9亞型AIV 基因還將進(jìn)一步發(fā)生變異，故更需要加強(qiáng)H9亞型AIV 的監(jiān)測(cè)。

H9亞型AIV 的不斷重組變異，導(dǎo)致以往檢測(cè)方法已經(jīng)不能滿足當(dāng)前流行株檢測(cè)的需要。故本研究根據(jù)H9亞型AIV HA 基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，根據(jù)基因比對(duì)，分析保守區(qū)域，經(jīng)同源性分析后，篩選出一組特異性好、檢測(cè)下限達(dá)10-4ng/μL 的探針、引物，并建立了高通量檢測(cè)方法，應(yīng)用于臨床檢測(cè)。經(jīng)驗(yàn)證，該方法能夠特異性地檢測(cè)H9亞型AIV，可滿足目前國內(nèi)H9亞型AIV 流行株的檢測(cè)需要，與國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19438.3—2004中的熒光RT-PCR檢測(cè)方法符合率達(dá)到100%，且能在1 h 能完成對(duì)未經(jīng)培養(yǎng)臨床樣品的高通量檢測(cè)，可以滿足大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的需要。