孫翔 余凡 許榮宸 李鋒 黃鸝

甲基丙烯酸羥乙酯（2-Hydroxyethyl methacrylate，HEMA）是牙科樹脂材料中的常見成分。作為親水性小分子，在牙科粘接劑中作為溶劑成分，可以改善粘接劑中親水／疏水單體之間的不匹配性，減少相分離［1-2］。HEMA含有一個(gè)可聚合的甲基丙烯?；鶊F(tuán)及親水性基團(tuán)，用于牙本質(zhì)粘接時(shí)可以改善脫礦牙本質(zhì)表面的潤(rùn)濕性能，促進(jìn)粘接劑在脫礦牙本質(zhì)中的滲透，因此，HEMA可以說是一種粘接促進(jìn)單體［1，3］。HEMA的親水性基團(tuán)與牙本質(zhì)具備一定的親和性，研究表明HEMA可以影響牙本質(zhì)膠原的硬度和滲透性及熱穩(wěn)定性［4-6］。牙本質(zhì)經(jīng)過HEMA處理后，更加耐酸蝕脫礦［7］。但目前并不清楚HEMA是通過何種作用來(lái)對(duì)牙本質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，關(guān)于其是否和脫礦牙本質(zhì)膠原起到化學(xué)結(jié)合作用，也一直存有爭(zhēng)議［8］。本文旨在探討HEMA與牙本質(zhì)膠原的作用形式。

1 材料與方法

1.1 傅立葉紅外光譜分析（fourier transform infrared spectrum analysis，F(xiàn)TIR）

新鮮拔除的健康無(wú)齲壞的第三磨牙，使用慢速切割機(jī)（沈陽(yáng)科晶自動(dòng)化設(shè)備制造有限公司）流水下磨除釉質(zhì)，制備1 mm厚度的牙本質(zhì)片，800目SiC砂紙打磨，37%磷酸完全脫礦，沖洗后完全干燥。在傅立葉紅外光譜儀（島津，F(xiàn)TIR-8400s，日本）上檢測(cè)處理前的牙本質(zhì)膠原的紅外光譜圖，然后將試件浸泡到含HEMA的離心管中，處理10 min后超聲震蕩并用去離子水沖洗試件，吸水紙吸干后再次上機(jī)檢測(cè)得到處理后的紅外圖譜，圖譜的波長(zhǎng)范圍為1 000～4 000 cm-1。

1.2 干重測(cè)試

在慢速切割機(jī)流水冷卻下將40顆牙齒釉質(zhì)磨除，均勻磨除牙根表面1 mm厚度牙體組織后牙長(zhǎng)軸方向縱切成2 mm厚牙本質(zhì)片。在液氮中浸泡2 h后研磨成粉末，用0.5 mol／L EDTA（pH＝6.4）浸泡脫礦24 h該反應(yīng)在4℃條件下進(jìn)行以最大限度的維持牙本質(zhì)膠原三維結(jié)構(gòu)。然后將混合液在3 000 r／2 min 4℃條件下離心后棄掉上清液，使用去離子水沖洗后重復(fù)離心3次，孵箱脫水干燥后備用。稱取脫礦后干燥的牙本質(zhì)粉末2 g左右，置于含HEMA的EP管中，浸泡1 h后10 000 r／4 min離心，棄掉上清液后重復(fù)3次，干燥后稱取每管中牙本質(zhì)粉末干重，計(jì)算脫礦牙本質(zhì)粉末反應(yīng)前后質(zhì)量變化情況。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.3 分子對(duì)接模擬

分子對(duì)接采用MOE軟件中DOCK1模塊，由Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載靶標(biāo)蛋白I型膠原的3種晶體結(jié)構(gòu) 據(jù)（PDB ID：4OY5，1CGD2，1QSU3），作為分子對(duì)接的受體。利用MOE中的Structure Preparation1模塊對(duì)I型膠原蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理，包括修復(fù)缺失殘基原子以及非標(biāo)準(zhǔn)原子名稱等，然后利用Protonate 3D1模塊對(duì)蛋白進(jìn)行質(zhì)子化處理，分子力場(chǎng)采用AMBER12：ETH，溶劑化模型選擇Reaction Field（R-field）。通過MOE對(duì)HEMA的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化，作為分子對(duì)接的配體。采用柔性對(duì)接方法對(duì)初始構(gòu)象進(jìn)行基于力場(chǎng)的能量?jī)?yōu)化，并采用GBVI／WSA dG的結(jié)合自由能打分方法獲得小分子構(gòu)象的最優(yōu)結(jié)合構(gòu)象。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS17.0軟件對(duì)脫礦牙本質(zhì)與HEMA反應(yīng)前后干重變化量進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)（檢驗(yàn)水準(zhǔn) α＝0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 FTIR

HEMA與脫礦牙本質(zhì)反應(yīng)前后紅外結(jié)果如圖1。與HEMA作用前可觀察到牙本質(zhì)膠原的牙特征紅外峰酰胺I帶，位于1 634.44 cm-1，酰胺Ⅱ帶位于1 544.74 cm-1，酰胺Ⅲ帶位于1 238.36 cm-1，并未觀察到羥基磷灰石的磷酸特征峰，表明脫礦完全。當(dāng)脫礦牙本質(zhì)與HEMA作用后，酰胺I帶向低波數(shù)方向偏移，位于1 633.93 cm-1，同時(shí)在1 715.46 cm-1附近出現(xiàn)新的C＝O峰。

圖1 脫礦牙本質(zhì)與HEMA反應(yīng)前后紅外圖Fig 1 The FTIR diagram of demineralized dentin before and after the reaction with HEMA

2.2 干重測(cè)試

脫礦牙本質(zhì)粉末與HEMA反應(yīng)后平均干重顯著增加到2.008 2±0.002 8（P＜0.01）（表1）。

表1 脫礦牙本質(zhì)與HEMA反應(yīng)前后干重變化情況Tab 1 Dry weight changes before and after demineralized dentin reacts with HEMA

2.3 分子對(duì)接

通過分子對(duì)接，獲得小分子與I型膠原蛋白的結(jié)合模式。HEMA與3種I型膠原分子結(jié)構(gòu)的二維和三維蛋白結(jié)合模式如圖2，小分子HEMA均以黃色著色，結(jié)合口袋中的熱點(diǎn)氨基酸殘基以青色顯示。從HEMA與I型膠原蛋白（4OY5）的結(jié)合模式二維圖中可以看到HEMA與蛋白形成了2個(gè)氫鍵相互作用，其中從直觀的結(jié)合模式三維圖上顯示小分子HEMA結(jié)構(gòu)中的羰基氧原子與I型膠原蛋白上的氨基酸殘基Gly16的骨架氮原子形成氫鍵相互作用，羥基氧原子與蛋白上的氨基酸殘基Pro14的骨架羰基氧原子形成氫鍵相互作用，相應(yīng)的結(jié)合自由能為-14.51 kJ／mol。從HEMA與I型膠原蛋白（1CGD）的結(jié)合模式二維圖中可以看到HEMA與蛋白形成了2個(gè)氫鍵相互作用，其中從直觀的結(jié)合模式三維圖上顯示小分子HEMA結(jié)構(gòu)中的羥基氧原子與I型膠原蛋白上的氨基酸殘基Hyp14的羥基氧原子以及Gly12的羰基氧原子形成氫鍵相互作用。相應(yīng)的結(jié)合自由能為-15.09 kJ／mol。從HEMA與I型膠原蛋白的結(jié)合模式二維圖（1QSU）中可以看到HEMA與蛋白形成了2個(gè)氫鍵相互作用，其中從直觀的結(jié)合模式三維圖上顯示HEMA結(jié)構(gòu)中的羥基氧原子以及羰基氧原子與I型膠原蛋白上的氨基酸殘基Lys14的側(cè)鏈氮原子形成氫鍵相互作用。相應(yīng)的結(jié)合自由能為-14.85 kJ／mol。

圖2 I型膠原蛋白與HEMA的相互作用三維圖Fig 2 The 3D mode of the reaction between type I collagen and HEMA

3 討 論

在牙本質(zhì)粘接過程中，牙本質(zhì)在磷酸或其他酸性單體的作用下，礦物質(zhì)溶解，暴露疏松的膠原網(wǎng)，進(jìn)而樹脂單體滲入并包裹膠原網(wǎng)，固化后和膠原一起形成混合層，產(chǎn)生微機(jī)械嵌合力，這是牙本質(zhì)粘接的基本原理。因此，目前普遍認(rèn)為牙本質(zhì)粘接固位主要是依靠機(jī)械結(jié)合作用，膠原僅通過物理作用整合到混合層中。但是體外研究發(fā)現(xiàn)，HEMA處理后牙本質(zhì)膠原的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度上升，熱變性溫度降低，這表明HEMA可能與牙本質(zhì)膠原起作用，從而影響到了牙本質(zhì)膠原的結(jié)構(gòu)特征［6，9］。

通過脫礦牙本質(zhì)與HEMA反應(yīng)的紅外可以看出，牙本質(zhì)膠原的酰胺I帶向低波數(shù)方向偏移，這表明HEMA與牙本質(zhì)膠原產(chǎn)生了相互作用，導(dǎo)致偏移［10］。同時(shí)在1 715.46 cm-1附近新出現(xiàn)的C＝O峰為HEMA的特征基團(tuán)，這可能是因?yàn)镠EMA通過物理吸附或化學(xué)作用結(jié)合到膠原分子上。本實(shí)驗(yàn)中處理后的脫礦牙本質(zhì)經(jīng)過了10 min的超聲震蕩和流水沖洗，可以最大程度的牙本質(zhì)淺層HEMA殘留的影響，排除物理吸附作用。

Pashley等［11］研究發(fā)現(xiàn)脫礦的牙本質(zhì)可以吸收HEMA，但與牙本質(zhì)膠原的膨脹狀態(tài)有關(guān)。在紅外實(shí)驗(yàn)中使用的是脫礦后完全干燥的牙本質(zhì)，由于失水后牙本質(zhì)膠原纖維間的氫鍵作用，膠原網(wǎng)塌陷體積收縮，因此可能會(huì)降低HEMA與膠原分子的結(jié)合機(jī)率，并不利于觀測(cè)反應(yīng)情況［12］。在干重實(shí)驗(yàn)中使用低溫條件下制備的牙本質(zhì)粉末進(jìn)行反應(yīng)，保持了膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)增加了HEMA與膠原分子作用的機(jī)會(huì)，可以很好的觀察到二者的反應(yīng)情況。干重變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與紅外結(jié)果一致，脫礦牙本質(zhì)粉末與HEMA反應(yīng)后干重量增加，證實(shí)了HEMA與牙本質(zhì)膠原的結(jié)合作用。

分子對(duì)接（molecular docking）是依據(jù)配體與受體作用的“鎖-鑰原理”，模擬小分子配體與受體生物大分子相互作用來(lái)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的方法，常用于藥物的設(shè)計(jì)篩選。本實(shí)驗(yàn)通過分子對(duì)接可以預(yù)測(cè)HEMA與膠原分子的結(jié)合模式和親合力。牙本質(zhì)中的I型膠原的結(jié)構(gòu)有3種，氨基酸序列有一定差異［4OY5：（Gly-Pro-Hyp）10，1CGD：（PROHYP-GLY）4-（PRO-HYPALA）-（PRO-HYP-GLY）5，1QSU：（PRO-HYP-GLY）4-（GLU-LYS-GLY）-（PRO-HYP-GLY）5］，基本結(jié)合位點(diǎn)在第5個(gè)重復(fù)單位，即編號(hào)為13～15位的氨基酸［13］。對(duì)接結(jié)果顯示HEMA與3種I型膠原分子結(jié)構(gòu)均能形成氫鍵作用，結(jié)合自由能均為負(fù)值，表明二者之間的相互作用可以自發(fā)進(jìn)行。HEMA分子上的羰基氧原子和羥基氧原子具備較高的反應(yīng)活性，可以和膠原分子氨基酸殘基上的骨架氮原子、羥基氧原子或羰基氧原子發(fā)生作用。Nishiyama等［14］使用13C NMR觀察HEMA與牙本質(zhì)膠原的作用，認(rèn)為HEMA與膠原的酯羰基間形成氫鍵，該作用能促進(jìn)粘接劑單體與牙本質(zhì)膠原的雜化，提高粘接界面的結(jié)合力。也有研究認(rèn)為HEMA并不與膠原側(cè)鏈中的賴氨酸反應(yīng)；但是脫礦牙本質(zhì)與HEMA親和性好，可以大量吸附HEMA［4］。

盡管該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HEMA與牙本質(zhì)膠原分子間通過氫鍵作用結(jié)合，但在實(shí)際牙本質(zhì)粘接過程中，牙本質(zhì)膠原中結(jié)合水的存在會(huì)影響HEMA與膠原活性基團(tuán)的接觸。Hiraishi等［8］使用飽和轉(zhuǎn)移差譜核磁研究了水環(huán)境下二者的相互作用，并未觀察到信號(hào)轉(zhuǎn)移，表明水抑制了HEMA與膠原分子的直接相互作用。在濕粘接條件下，由于HEMA的蒸發(fā)速率為水的1／32，隨著水分的蒸發(fā)，HEMA濃度增加，降低了水的蒸發(fā)壓力，殘留水分不易揮發(fā)，導(dǎo)致膠原纖維間存在殘留水分［15］。而且在有水存在的條件下，HEMA在聚合前溶液形成凝膠狀；固化后吸水也會(huì)引起水潴留［16］。牙本質(zhì)膠原周圍水與HEMA共存的狀態(tài)可以在一定程度上維持膠原網(wǎng)的疏松膨脹狀態(tài)，有利于樹脂單體的滲透，提高即刻粘接強(qiáng)度［17］。但殘留水分會(huì)增加膠原酶解和樹脂水解的風(fēng)險(xiǎn)，影響牙本質(zhì)粘接的耐久性。因此，考慮到HEMA與牙本質(zhì)膠原的復(fù)雜的反應(yīng)環(huán)境，濕粘接條件下HEMA與膠原的氫鍵作用對(duì)粘接力的貢獻(xiàn)仍然有待進(jìn)一步研究。