魏亞茹 吳健 段曉峰 高瓊 瞿澤豐

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔惡性腫瘤的80%［1］。OSCC與慢性刺激因素（如煙草，吸煙，酒精和嚼檳榔）有關(guān)［2］。其致死原因主要是局部復(fù)發(fā)及全身轉(zhuǎn)移。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年全世界新增口腔頜面部惡性腫瘤患者中，發(fā)展中國家超過32萬人，死亡近9萬人［3-4］。我國人口基數(shù)大，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年新發(fā)病例約4.56萬人，且近年發(fā)病率呈上升趨勢。所以口腔頜面部惡性腫瘤的防治不容忽視［3，5］。雖然目前手術(shù)切除是治療OSCC最好的辦法，但是根治性切除，術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率仍較高，生存率＜50%，精準(zhǔn)治療是未來推崇的趨勢，通過基因組或蛋白質(zhì)組學(xué)高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)的新生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物模式能夠?qū)δ承┤祟惣膊?，特別是惡性腫瘤進(jìn)行更可靠的早期診斷。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［6］，結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp）在口腔鱗癌血清中的表達(dá)高于健康人的血清，這表明觸珠蛋白可能成為口腔鱗癌的血清腫瘤標(biāo)記物之一。目前，腫瘤血管生成的及抗血管生成的研究是治療腫瘤的一個(gè)新方向。因此，本文旨在研究結(jié)合珠蛋白在口腔鱗癌和健康人組織中的表達(dá)差異，并探討結(jié)合珠蛋白在口腔鱗癌中與血管生成的關(guān)系。

本研究采用Western blot技術(shù)，比較Hp在口腔鱗狀細(xì)胞癌和健康人組織中的表達(dá)差異，再應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察Hp在血管周圍的分布情況，用Weidner校正法計(jì)數(shù)微血管密度（microvessel density，MVD）。分析在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，結(jié)合珠蛋白與血管生成的關(guān)系，為臨床應(yīng)用抗血管生成來治療腫瘤提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究標(biāo)本 標(biāo)本來源于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)，未采用針對腫瘤的治療如手術(shù)、放療、化療等，且經(jīng)病理證實(shí)的口腔鱗癌組織標(biāo)本30例，對照口腔黏膜組織標(biāo)本30例?？谇击[癌組織標(biāo)本來源情況：男性23例，女性7例，年齡45～75歲，平均年齡60.2歲；其中高分化鱗癌21例，中分化鱗癌9例；對照口腔黏膜組織標(biāo)本來源于拔牙病人，體檢健康，既往無腫瘤史。

1.1.2 主要試劑 兔抗人Hp單克隆抗體（ab13123-6，1∶6 000，Abcam公司，英國）、內(nèi)參鼠抗人GAPDH單抗（HRP-60004，1∶2 000，三鷹公司）、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（GTX213110-01，1∶5 000，Gene Tex公司，美國）、0.22μm PVDF膜、一抗稀釋液、二抗稀釋液、BSA封閉液、BCA蛋白定量試劑盒［PierceTMBCA Protein Assay Kit（Prod＃23227），賽默飛，美國］；SDS-PAGE凝制膠試劑盒［P0012A，北京索萊寶（Lot.No.2016042-1）］；ECL-Plus發(fā)光試劑（Millipore Immobilon Western公司，美國）等；兔抗人Hp單克隆抗體（1∶100，Gene Tex公司，美國）；鼠抗人CD31單克隆抗體（1∶200）、山羊血清封閉液（ZLI-9022）、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（BF06097）、Polymer雙染檢測試劑盒（DS-0001）（中杉金橋公司）等。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 -80℃冰箱（TSX2305GA，賽默飛，美國）；酶標(biāo)儀（ELx800，Bio-Tek，美國）。顯微鏡（TE2000-U，Nikon公司，日本）；超凈工作臺(tái)（SWCJ-1F，濟(jì)南博涵生物科技有限公司）、石蠟切片機(jī)（RM2235，Lecia，德國），Exceed-AC-08型超純水儀（Exceed-AC-08，成都艾科有限公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Western blot免疫印跡法 所有標(biāo)本-80℃保存待用。提取蛋白時(shí)，于冰上切取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織置于1.5 mlEP管中，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，置于冰塊上進(jìn)行手動(dòng)研磨直組織徹底溶解，于高速離心機(jī)中以12 000 r／min，4℃高速離心15 min后，取上清液，棄沉淀物。BCA法測定總蛋白濃度、變性蛋白；制膠、電泳；轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后TBST洗3次，5 min／次；室溫封閉1.5 h；一抗兔抗人Hp單抗4℃冰箱過夜孵育；TBST洗3次，8 min／次，結(jié)束后羊抗兔二抗室溫孵育1 h；TBST洗3次，8min／次，結(jié)束后加入ECL發(fā)光液顯色，化學(xué)發(fā)光儀曝光顯色，用Image-Pro Plus進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法 所有OSCC組織及口腔正常組織首先均經(jīng)中性甲醛固定，然后進(jìn)行石蠟包埋和連續(xù)切片（5μm）。60℃烤片1 h；脫蠟、水化；滅活內(nèi)源性過氧化物酶和堿性磷酸酶活性15 min；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)20 min，室溫冷卻，PBST洗3次，5 min／次；山羊血清室溫封閉1 h；滴加配制好的一抗（鼠抗人CD31單抗1∶100、兔抗人Hp單抗1∶100，二者混勻），4℃過夜；室溫復(fù)溫30 min，PBST洗3次，5 min／次；滴加配置好的二抗（辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG聚合物、堿磷酶標(biāo)記羊抗兔IgG聚合物，二者混勻），室溫孵育30 min，PBST洗3次，2 min／次；DAB顯色液顯色，PBST洗3次，2 min／次；GBI-久紅溶液顯色，蒸餾水沖洗終止顯色；封片。每張切片皆經(jīng)過半定量計(jì)分系統(tǒng)進(jìn)行評估。先將染色陽性的病理切片置于100倍的鏡下觀察抗原的表達(dá)情況，然后換成400倍的鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，按陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行分級，由2位病理科醫(yī)生進(jìn)行盲評。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對以上數(shù)據(jù)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot免疫印跡法結(jié)果

Western blot檢測30例OSCC及30例對照口腔黏膜組織表達(dá)情況見圖1。

圖1 Western blot檢測Hp在口腔鱗癌及對照組組織中的表達(dá)Fig 1 Hp expression in OSCC and control tissues examined by Western blot

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Hp主要位于OSCC細(xì)胞間質(zhì)中，呈紅色；CD31定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜，呈棕黃色。在OSCC中可見大量的微血管存在，血管呈條索狀、點(diǎn)狀、出芽狀及血管內(nèi)皮細(xì)胞呈族狀聚集；對照組織中微血管明顯減少。Hp均圍繞著血管分布，在OSCC中高表達(dá)，染色深；對照組織中低表達(dá)，染色淺（圖2）。OSCC組織中Hp的表達(dá)明顯高于對照組織（P＜0.01）（表1）。

Hp表達(dá)與OSCC臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系見表2。不同組織學(xué)分級的口腔鱗癌間質(zhì)中，其Hp的表達(dá)率有明顯的差異，分化程度越低者，Hp表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅲ～Ⅳ期中Hp的表達(dá)較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；但Hp的表達(dá)與患者年齡、性別、無顯著關(guān)系（P＞0.05）。

圖2 Hp在對照口腔組織及口腔鱗癌組織中的表達(dá)（免疫組化，×400）Fig 2 Hp expression in control oral tissue and OSCC（IHC，×400）

表1 口腔鱗癌組織及對照組織中Hp的表達(dá) （n＝30）Tab 1 Hp expression in OSCCand control tissues（n＝30）

OSCC中Hp的表達(dá)與微血管密度（MVD）的關(guān)系見表3。OSCC中Hp陽性表達(dá)的MVD高于Hp陰性者（P＜0.05）。

表3 OSCC中Hp的表達(dá)與MVD的關(guān)系Tab 3 The relationship between Hp expression and MVD in OSCC

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是一類嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，占口腔惡性腫瘤的80%，在頭頸鱗癌（HNSCC）中也占較大比例，死亡率極高。傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療因其各自的局限性而不能達(dá)到滿意的療效。雖然目前手術(shù)切除是治療OSCC最好的辦法，但是根治性切除，術(shù)后5年的復(fù)發(fā)率仍較高，生存率＜50%［7］。因而研究新的抗腫瘤治療的靶點(diǎn)就顯得尤為重要。

Hp由Polonovski和Jayle首次發(fā)現(xiàn)，是一種分子量為85 000的急性期反應(yīng)蛋白［8］。Hp又叫觸珠蛋白，是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，廣泛存在于人類和許多哺乳動(dòng)物的血清及其他體液中。主要功能是通過與血清中游離的血紅蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的結(jié)合珠蛋白-血紅蛋白復(fù)合物，將血紅蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟中代謝，從而避免血紅蛋白和鐵從腎臟丟失及其對腎臟的損傷。此外，還參與宿主抗感染、損傷組織的修復(fù)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其血清含量在感染、創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤、心肌梗死等病理狀態(tài)時(shí)顯著升高。除以上的功能外，Hp還具有抗氧化、抗菌、抑制前列腺素合成及NO功能、促進(jìn)血管生成及調(diào)節(jié)免疫等功能［9］。對肺癌［10］、胰腺癌［11］、肝癌［12］患者血清與正常人血清差異蛋白的研究提示Hp在病理血清中表達(dá)上調(diào)。蛋白質(zhì)組學(xué)識(shí)別Hp作為口腔鱗狀細(xì)胞癌中的新型血漿生物標(biāo)志物的研究中發(fā)現(xiàn)觸珠蛋白水平升高與OSCC臨床分期呈強(qiáng)相關(guān)（Pb 0.01），表明Hp作為敏感血漿生物標(biāo)志物具有很大的潛力，可用于早期檢測OSCC患者［13］。Hp表達(dá)與HNSCC患者復(fù)發(fā)率的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)倆者密切相關(guān)，而且多變量分析證實(shí)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高，因此Hp的細(xì)胞表達(dá)可能是HNSCC中的預(yù)后因子［14］。

1979年，F(xiàn)olkman等［15］提出“腫瘤血管生成（angiogenesis，AG）的概念”，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長分為2個(gè)階段：無血管期和血管期。在無血管期，腫瘤直徑處于1～2 mm，此時(shí)腫瘤生長依賴于周圍原有血管系統(tǒng)通過彌散獲得氧和營養(yǎng)物質(zhì)，這嚴(yán)重的限制了腫瘤細(xì)胞的生長及其向遠(yuǎn)處擴(kuò)散的可能性；當(dāng)腫瘤直徑大于1～2 mm時(shí)，需要誘導(dǎo)生成新的血管來獲取血供，否則腫瘤就會(huì)因缺血缺氧發(fā)生壞死。實(shí)體腫瘤的生長及存活依賴血管形成，新生血管通過灌注形式為腫瘤細(xì)胞生長提供營養(yǎng)，也是腫瘤細(xì)胞代謝產(chǎn)物排泄的有效途徑，同時(shí)也是腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要途徑。大量研究表明，腫瘤血管生成與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

本課題組前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法建立人OSCC組織與正常口腔組織中的差異蛋白表達(dá)，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)Hp在口腔鱗癌外周血清中的表達(dá)高于健康人的血清，這表明觸珠蛋白可能成為口腔鱗癌的血清腫瘤標(biāo)記物之一。

實(shí)驗(yàn)采用Western blot技術(shù)，比較Hp在OSCC和健康人組織中的表達(dá)差異，再應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察Hp在血管周圍的分布情況，用Weidner校正法計(jì)數(shù)微血管密度（MVD）［15］。結(jié)果提示Hp在OSCC組織中表達(dá)顯著升高；OSCC中的MVD明顯高于正常組織；在OSCC和對照組織中，Hp均圍繞著血管分布，且Hp在OSCC中的表達(dá)明顯較對照組織升高。這表明在OSCC中，Hp的表達(dá)可能和MVD呈正相關(guān)，Hp對腫瘤的血管生成可能有促進(jìn)作用。有關(guān)它在OSCC中的具體作用，本課題組將在以后的研究中繼續(xù)探索。目前，腫瘤血管生成的及抗血管生成的研究是治療腫瘤的一個(gè)方向［16］，相信Hp不僅能為OSCC的早期診斷及預(yù)后評估提供依據(jù)，還能為OSCC的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。