王春芳 王天玨

黏液表皮樣癌（MEC）是頭頸部最常見的原發(fā)性涎腺腫瘤［1］，占涎腺惡性腫瘤的35%，高分化黏液表皮樣癌一般為無痛性緩慢生長腫塊，惡性程度不高，但低分化MEC的生長速度快，惡性程度高且常累及周圍神經(jīng)，屬高度惡性腫瘤，其5年生存率僅有30%［2］。

多藥耐藥相關(guān)蛋白（MPR1）一直被認(rèn)為是一個(gè)能量依賴的膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)子，通過轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物到細(xì)胞外引起腫瘤耐藥，與腫瘤化療的不良預(yù)后高度相關(guān)［3］。但也有研究發(fā)現(xiàn)MRP1通常在成人肝臟中的表達(dá)量不可查，但肝損傷后，再生區(qū)域的肝細(xì)胞中MRP1表達(dá)量卻顯著升高［4］，加之MRP1本身也是細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)子，懷疑MRP1表達(dá)量的改變是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)底物的濃度來影響了細(xì)胞的生物學(xué)特征。

本次研究發(fā)現(xiàn)高分化MEC中MRP1高表達(dá)，但低分化MEC中的MRP1表達(dá)量顯著減少。為研究MRP1在MEC中發(fā)揮了什么作用的，利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)MRP1表達(dá)，并通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MEC細(xì)胞腫瘤生物學(xué)特性的改變，為將來MEC的個(gè)體化治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 黏液表皮樣癌患者腫瘤樣本

收集北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平分院病理科15例高分化MEC和15例低分化MEC患者的組織切片樣本，這些患者均接受了MEC切除術(shù)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

本研究使用免疫組織熒光的方法來檢測MRP1在MEC腫瘤組織中的表達(dá)和定位。樣本固定、包埋，切片（5μm），脫蠟。依據(jù)使用說明，使用鏈霉素生物素過氧化物酶檢測試劑盒（北京中山生物技術(shù)公司）進(jìn)行顯色。MRP1鼠抗人單克隆一抗（1∶200；Santa Cruz，Biotechnology公司，USA）孵育過夜。熒光二抗（15μg／ml Affini-Pure羊抗小鼠，北京中山生物技術(shù)公司），37℃孵育30 min。DAPI（1μg／ml）襯染細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡（FluoViewTMFV1000；Olympus公司，日本），40倍／1.2光圈觀測。MRP1表達(dá)指數(shù)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法分為1～9分［5］。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

高轉(zhuǎn)移黏液表皮樣癌細(xì)胞系MC3由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院細(xì)胞生物教研室贈與。MC3細(xì)胞培養(yǎng)在含10%RPMI1640胎牛血清（Gibco BRL）培養(yǎng)基中，內(nèi)含青霉素和鏈霉素（100 U／ml，Sigma-Aldrich，USA）。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染

MRP1 shRNA knockdown利用慢病毒的PLKO ShRNA系統(tǒng)，利用Puromycin進(jìn)行篩選。MC3細(xì)胞種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為40%，上清吸除后，加入病毒液（MOI＝20），4 d后檢測GFP熒光表達(dá)情況，把穩(wěn)定感染慢病毒MRP1-shRNA的細(xì)胞記為MC3-S，把穩(wěn)定感染shRNA陰性對照慢病毒的MC3細(xì)胞標(biāo)記為MC3-NC。

1.5 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

使用總RNA提取試劑盒（OMIKA，California，美國）提取細(xì)胞總RNA，使用Takara試劑盒（Reverse Transcriptase，Takara，日本）將RNA反轉(zhuǎn)錄為總cDNA（10μl），待用，反轉(zhuǎn)錄試劑混合液10 mmol／L，加總RNA模板5μl混合后離心，42℃，15 min；95℃，5 min；4℃，10 min。合成單鏈cDNA作為實(shí)時(shí)定量PCR的模板，引物序列見表1，GAPDH為內(nèi)參。實(shí)時(shí)定量qPCR使用Premix Ex TagTMⅡ試劑盒（Takara），95℃30 s；95℃5 s，56℃34 s，72℃15 s，45個(gè)循環(huán)。相對表達(dá)水平用ΔΔCT顯示。

表1 PCR引物序列及反應(yīng)條件Tab 1 Primer sequences and PCR conditions

1.6 Western blot

冰浴收集細(xì)胞裂解液（50 mmol／L Tris-HCl，150 mmol／L NaCl，50 mmol／L EDTA，1%NonIdet P-40，0.5 mmol／L phenylmethylsulfonyl fluoride，2μg／ml pepstatin A），蛋白定量，蛋白樣本（20μg／ml）用12%分離膠分離，并電轉(zhuǎn)位（100 V，90 min）至硝酸纖維素膜（Sigma-Aldrich），5%脫脂奶粉封閉，小鼠單克隆抗體（1∶500，Santa Cruz）4℃過夜，IRDyeTM800兔抗小鼠二抗（1∶20 000；Rockland Inc，USA）孵育1.5 h，Odyssey imaging系統(tǒng)（LI-COR Inc.，Lincoln）顯影，β-actin（1∶1 000，Boster公司，USA）用來作為對比內(nèi)參。

1.7 MTT分析

分別將處于對數(shù)生長期的不同組別MC3細(xì)胞株接種于96孔板，每孔約3 000個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，每天于相應(yīng)孔中加新鮮配制的MTT溶液（5 g／L）20μl，37℃培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)上清，每孔加150μL DMSO振蕩（10 min）以溶解結(jié)晶；490 nm波長在ELISA儀上測定各孔光吸收值（490 nm）；以每5個(gè)重復(fù)孔A值的平均數(shù)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

分別將500個(gè)細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿，每3 d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)2～3周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，20%甲醇固定15 min，Giemsa液染色40 min，用克隆計(jì)數(shù)儀自動計(jì)數(shù)，比較不同背景下的細(xì)胞克隆形成能力的差異。

1.9 免疫缺陷小鼠的MC3移植瘤模型

選取4～6周齡、體重18～20 g的雄性裸鼠為實(shí)驗(yàn)對象。無菌條件下收獲培養(yǎng)的MEC細(xì)胞，PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106／ml，0.1 ml細(xì)胞液注射于小鼠背部皮下。待10 d后細(xì)胞實(shí)體瘤形成，每3 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的大小，腫瘤的體積公式：V＝d2×D／2（d：腫瘤的短徑，D：腫瘤的長徑），連續(xù)記錄21 d。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 MRP1在高分化MEC中的表達(dá)量顯著高于低分化MEC中的表達(dá)量

通過免疫組織熒光對高分化及低分化MEC組織石蠟切片進(jìn)行染色，并進(jìn)行評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MRP1在所有的黏液表皮樣癌樣本（30／30）中有表達(dá)。然而在高分化MEC中，MRP1主要位于細(xì)胞膜上，而在低分化MEC中，MRP1主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，綠色熒光為為MRP1蛋白，藍(lán)色為DAPI的細(xì)胞核襯染，顯示了MRP1在高分化MEC中和低分化MEC的亞細(xì)胞定位：免疫熒光染色可見MRP1主要位于高分化黏液表皮樣癌的細(xì)胞膜上且表達(dá)量很高，但在低分化黏液表皮樣癌中卻主要位于細(xì)胞質(zhì)中，切表達(dá)量明顯較低；（圖1）。而且，統(tǒng)計(jì)分析MRP1在組織切片中的表達(dá)指數(shù)（EI），MRP1在高分化MEC中的表達(dá)量（EI＝5.7±1.2）顯著高于MRP1在低分化MEC中的表達(dá)量（EI＝1.4±0.3，P＜0.01）（圖2A）。

圖1 MRP1在MEC中的表達(dá) （IHC，×40）Fig 1 MRP1 expression in MEC （IHC，×40）

圖2 MRP1表達(dá)量的下調(diào)顯著增強(qiáng)了黏液表皮樣癌細(xì)胞的生長速度Fig 2 Growth promotion of MEC cells by down-regulation of MRP1 expression

2.2 MRP1 shRNA顯著下調(diào)MC3中的MRP1表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)：與MC3-NS細(xì)胞對比，MC3-S細(xì)胞內(nèi)MRP1的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（N＝3，P＜0.01），值得注意的是，MC3／5FU-S細(xì)胞內(nèi)，MDR1的mRNA表達(dá)量也下降了66%±8.5%（P＜0.01）（圖2B）。Western blot驗(yàn)證了該結(jié)果，與MC3-NS細(xì)胞相比，MC3-S細(xì)胞中的MRP1蛋白表達(dá)量也明顯下降（圖2C）。

2.3 下調(diào)MRP1后MEC細(xì)胞生長速度顯著下降

MTT法檢測MC3-NS細(xì)胞和MC3-S細(xì)胞的生長速度。從第3天開始，MC3-S細(xì)胞的生長速度就開始顯著低于MC3-NS（圖2D）。單克隆形成也顯示MC3-S細(xì)胞（31±7）的克隆形成能力就顯著低于MC3-NS細(xì)胞（116±14，P＜0.01），單克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示MRP1的下調(diào)顯著增強(qiáng)了MC3的單克隆形成能力（圖2E）；下調(diào)MRP1顯著增加了MC3細(xì)胞的體內(nèi)生長速度（圖2F）。而裸鼠成瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示MRP1的下調(diào)顯著降低的MEC細(xì)胞的惡性程度，與MC3-NC組相比（1 186±150）mm3，顯MC3-S組的腫瘤生長速度著降低，腫瘤體積顯著減?。?70±41）mm3（P＜0.01）。

3 討 論

MRP1一直被認(rèn)為是腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥的重要蛋白，前期研究也發(fā)現(xiàn)MRP1在MEC中高表達(dá)，是導(dǎo)致MEC多藥耐藥的重要因素之一，下調(diào)MRP1可以顯著降低多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性，且MRP1的表達(dá)與多種腫瘤的化療預(yù)后高度相關(guān)［6］。但是前期研究發(fā)現(xiàn)惡性程度更高的低分化MEC中，MRP1的表達(dá)量卻較高分化MEC更少。因此，MRP1可能在黏液表皮樣癌中還發(fā)揮著其它作用。

為了驗(yàn)證相關(guān)假設(shè)，通過shRNA下調(diào)MEC細(xì)胞（MC3細(xì)胞系）中MRP1的表達(dá)，并通過qPCR和Western blot驗(yàn)證了MRP1的下調(diào)水平，發(fā)現(xiàn)的是shRNA顯著下調(diào)了MC3內(nèi)的MRP1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)（P＜0.01）。在下調(diào)MRP1表達(dá)水平后，通過MTT檢測了MC3細(xì)胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)MRP1的下調(diào)顯著增強(qiáng)了MC3細(xì)胞的生長速度；而MC3細(xì)胞的單克隆形成實(shí)驗(yàn)也顯示MRP1的下調(diào)顯著增強(qiáng)了MC3細(xì)胞的單克隆形成能力。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)MRP1的下調(diào)可通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力增加腫瘤細(xì)胞的惡性程度。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論，將下調(diào)MRP1后的MC3細(xì)胞（MC3-S）注射于裸鼠皮下，并檢測其生長速率，進(jìn)一步驗(yàn)證MRP1的下調(diào)可顯著增加了MC3細(xì)胞在體內(nèi)的增殖速率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)MRP1的下調(diào)會顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖能力和克隆形成能力，雖然大量研究表明，MRP1的下調(diào)可顯著降低腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性，但本研究解釋了為什么無法通過下調(diào)耐藥基因來治愈腫瘤的原因。并未揭示MRP1增加黏液表皮樣癌惡性程度的機(jī)制，但有研究發(fā)現(xiàn)MRP1是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）的含量來調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)功能的，MRP1是GSH的重要轉(zhuǎn)運(yùn)子［7］，而GSH是細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化物質(zhì)，可減緩細(xì)胞衰老并增強(qiáng)細(xì)胞生存能力［8］，MRP1的減少可能增加了細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，從而減少外源性物質(zhì)所帶來的傷害，這也許正是無法通過下調(diào)耐藥基因來治愈腫瘤的原因。

總而言之，前期研究發(fā)現(xiàn)了黏液表皮樣癌細(xì)胞中高表達(dá)MRP1，但并未解釋MRP1除了作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之外的細(xì)胞機(jī)制。本研究進(jìn)一步完善了MRP1在MEC中相關(guān)分子機(jī)制，并且我們認(rèn)為MRP1可作為MEC的新的預(yù)后標(biāo)志物進(jìn)一步發(fā)揮作用，但詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。