崔真真 柳志文

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是頭頸部常見的惡性腫瘤，占口腔頜面部惡性腫瘤的比例高80%，患者生存率低，預(yù)后差［1］?？谇话装撸∣LK）是最常見的口腔角化異常，WHO定義其屬于癌前病變。研究表明，3%～17%的OLK會轉(zhuǎn)變?yōu)榘?，異常增生程度越高，癌變風(fēng)險越大［2］。目前臨床尚無有效預(yù)防OLK癌變的方法，早期發(fā)現(xiàn)OLK的惡性轉(zhuǎn)化，將對降低OLK癌變率和OSCC發(fā)生率具有重要意義。

研究表明［3-4］，環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）在促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲和增殖過程中與肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）／肝細(xì)胞生長因子受體（C-met）信號傳導(dǎo)通路有著密切的關(guān)系。目前C-met和Cox-2兩者在口腔黏膜病變中的相互作用，尚未見文獻(xiàn)報道。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法對NOM，OLK以及OSCC組織中C-met和Cox-2蛋白進(jìn)行檢測，探究C-met和Cox-2在OLK和OSCC中的表達(dá)情況及兩者的相關(guān)性，以期為OLK的早期癌變的診斷提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選擇

OLK和OSCC標(biāo)本均選自中南大學(xué)湘雅口腔醫(yī)院病理科蠟塊標(biāo)本，10例NOM組織來自中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院智齒拔除術(shù)患者組織。其中OLK 22例，輕度異常增生7例，中度異常增生7例，重度異常增生8例。OSCC 20例，高分化14例，中低分化6例。所有病例均經(jīng)病理科2名中高級醫(yī)師確診，患者術(shù)前均未行放、化療。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人多克隆C-Met抗體（1∶200；25869-1-AP）、兔抗人Cox-2單克隆抗體（1∶300；12375-1-AP，5869-1-AP，武漢三鷹有限公司）；S-P試劑盒（PV9001）、DAB顯色試劑盒（ZLI-9018，北京中山金橋）；光學(xué)顯微鏡（BA210T，中國麥克奧迪集團(tuán)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫酶法。按下列操作步驟進(jìn)行：脫蠟、水化；高壓煮沸抗原修復(fù)；阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O2；滴加一抗（C-met／Cox-2）（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育30 min；DAB顯色；復(fù)染、各級酒精脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

C-met和Cox-2表達(dá)于胞漿中，以細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)定位明確、染色明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野，每個高倍視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。首先按染色強(qiáng)度評分：0分為無染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再按陽性細(xì)胞所占的百分比評分：陽性細(xì)胞＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。將染色強(qiáng)度記分和陽性細(xì)胞數(shù)得分相加為最后得分，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（++），5～6分為強(qiáng)陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 C-met及Cox-2在NOM，OLK和OSCC中的表達(dá)

在OSCC中，C-met陽性表達(dá)率80%，高于OLK（45.5%）及NOM（10.0%），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Cox-2在OSCC中陽性表達(dá)率85.0%，高于OLK（54.5%）及NOM（10.0%）（表1）。

表1 C-met及Cox-2在3種組織中的表達(dá)Tab 1 The expression of C-met and Cox-2 in 3 types of tissue

2.2 C-met與Cox-2表達(dá)的相關(guān)性

C-met與Cox-2在OLK中表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.568，P＜0.05，表2），在OSCC中表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.480，P＜0.05，表3）。

表2 C-met與Cox-2在OLK中表達(dá)的相關(guān)性Tab 2 The relationship between expression of C-met and Cox-2 in OLK

表3 C-met與Cox-2在OSCC中陽性表達(dá)的相關(guān)性Tab 3 The relationship between expression of C-met and Cox-2 in OSCC

3 討 論

口腔癌是全球公共衛(wèi)生問題，5年生存率約為50%［5］，口腔癌患者生存率低，預(yù)后差，因此對口腔癌的早期發(fā)現(xiàn)，尤其對癌前病變的診斷和干預(yù)極為重要。OSCC是口腔癌的常見類型，國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)90%以上的OSCC是由口腔癌前損害發(fā)展而來，但是目前OSCC發(fā)病機(jī)制仍不清楚，因此需進(jìn)一步研究OSCC的發(fā)病機(jī)制并尋求OSCC早期診斷及防治措施。

3.1 C-met蛋白

C-met蛋白是肝細(xì)胞生長因子的特異性配體，研究表明，C-met在甲狀腺癌，乳腺癌，肺癌和扁桃體鱗癌等呈現(xiàn)過度表達(dá)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用［6-9］。本研究發(fā)現(xiàn)C-met在NOM中微量表達(dá)，在OLK中呈部分陽性表達(dá)，在OSCC組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，各組間C-met蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，支持C-met參與口腔黏膜病變惡變過程的觀點(diǎn)［10］。Sun等［11］研究發(fā)現(xiàn)C-met異常表達(dá)可通過ERK／c-Fos通路最終導(dǎo)致口腔黏膜病變惡變的發(fā)生，與本研究一致。

圖1 C-met和Cox-2在3種組織中的表達(dá) （SP，×400）Fig 1 The expression of C-met and Cox-2 in 3 types of tissue （SP，×400）

C-met蛋白在OSCC的表達(dá)較OLK上皮細(xì)胞表達(dá)水平增高，提示C-met蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與黏膜惡變程度有關(guān)，C-met蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示與OLK進(jìn)展惡化有關(guān)。與以往研究C-met在癌前病變及癌癥中表達(dá)逐漸上調(diào)的報道一致，并且與腫瘤的惡變程度有關(guān)的結(jié)果相符合［12-13］。C-met的過度表達(dá)可能發(fā)生在OSCC的早期階段。Szturz等［14］曾報道C-met表達(dá)隨口腔黏膜病變病理分化程度、OSCC惡性度的增高而增加，C-met的表達(dá)與OSCC患者預(yù)后密切相關(guān)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可推斷C-met蛋白表達(dá)與OSCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為一個潛在的檢測OLK惡變和早期OSCC的標(biāo)志物。

3.2 Cox-2蛋白

本研究發(fā)現(xiàn)，Cox-2在NOM、OLK及OSCC中的陽性表達(dá)率明顯上調(diào)，陽性表達(dá)率分別為10%、54.5%、85%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且弱陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)率也呈升高趨勢，與Seyedmajidi等［15］研究結(jié)果一致，提示Cox-2在口腔黏膜組織惡變的初始階段就已經(jīng)參與并起到一定的作用，并且在口腔黏膜中的陽性表達(dá)率有隨著組織的惡變程度增強(qiáng)而表達(dá)增加的趨勢，可以初步判斷Cox-2蛋白與口腔的惡性病變程度相關(guān)。Wang等［16］發(fā)現(xiàn)Cox-2也是區(qū)分癌癥病理分期的良好標(biāo)志物，Cox-2高表達(dá)患者往往預(yù)后較差，Cox-2高表達(dá)在食道癌，霍奇金淋巴瘤等中也有報道［17-18］。因此Cox-2有望成為癌癥早期診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物。同時Hsu等［19］發(fā)現(xiàn)通過敲除Cox-2可以抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，為癌癥治療提供新的治療思路。

3.3 C-met與Cox-2相互作用

近年來研究發(fā)現(xiàn)C-met與Cox-2在許多腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，它們協(xié)同參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移。Stabile等［20］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，C-met與Cox-2抑制劑聯(lián)合使用可以有效增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用。Byun等［21］研究發(fā)現(xiàn)C-met受體抑制劑可導(dǎo)致Cox-2表達(dá)下降；平行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制Cox-2可引起C-met表達(dá)下降。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化方法研究OLK和OSCC中C-met與Cox-2的表達(dá)情況，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，C-met與Cox-2在OLK（P＜0.05）和OSCC（P＜0.05）中分別相關(guān)。兩者的顯著相關(guān)性提示兩者在OLK以及OSCC的發(fā)生、發(fā)展中存在相互作用。

推測C-met與Cox-2相互作用主要通過以下2種途徑：HGF與C-met受體結(jié)合，通過C-met磷酸化和ERK1／2通路，誘發(fā)激活Cox-2表達(dá)和前列腺素合成，即C-met—ERK1／2—Cox-2軸［3-4］。Cox-2被激活后進(jìn)一步激活EGFR刺激產(chǎn)生PEG2，PGE2與其受體相結(jié)合，通過EGFR通路和非HGF依賴型C-met磷酸化，進(jìn)一步激活C-met，即Cox-2-PGE2-EGFR-C-met軸［20，22］。由此可以推測，C-met—ERK1／2—Cox-2軸和COX-2-PGE2-EGFR-C-met軸使得C-met與Cox-2在一個正反饋環(huán)中相互作用。C-met與Cox-2相互作用為進(jìn)一步探討OLK癌變發(fā)病機(jī)制以及探尋OLK治療新途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為OLK及OSCC雙靶向治療提供依據(jù)。