關為群 張楊安 李群 劉玲玲

牙髓是位于牙髓腔內疏松的結締組織，其對外來刺激能產生一系列的防御反應。對于外傷、齲病、機械性露髓的患牙，希望通過有效的蓋髓材料覆蓋于牙髓的暴露處，以消除感染、充分調動牙髓組織的再生修復能力，從而促進牙髓愈合，保存牙髓活力。研究發(fā)現，在牙髓損傷愈合的過程中有眾多的細胞因子參與如FGF-2、BMPs、VEGF等［1-2］，這些細胞因子在促進牙髓細胞增殖、分化以及修復性牙本質形成方面起著重要的作用［3-4］。

辛伐他汀是臨床上治療膽固醇高血脂癥、動脈粥樣硬化的一線藥物。近年來發(fā)現辛伐他汀除了降低血脂的作用外還具有促進牙髓細胞的增殖和分化，血管再生，抵抗炎癥反應等作用。本課題組前期體外實驗也發(fā)現辛伐他汀對牙髓細胞增殖和分化具有積極的作用［5］，因此本研究將進一步體內檢測辛伐他汀直接蓋髓術后牙髓組織VEGF及BMP-2的表達情況，對辛伐他汀促進牙髓細胞損傷后修復機制進行初步的探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡成年雄性SD大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）120只，清潔級，體重（200±5）g，口腔衛(wèi)生狀況良好，無齲齒及牙周疾病。本實驗經福建醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會批準。將上述的120只大鼠分為3組，即辛伐他汀-膠原蛋白海綿組（SIM組）、膠原蛋白海綿組（CS組）及氫氧化鈣組（CH組），每組40只。每只大鼠左上頜第一磨牙為實驗牙，并設對側上頜第一磨牙為正常對照牙。

1.2 主要的試劑與材料

辛伐他?。⊿igma，美國）；Ca（OH）2（上海二醫(yī)張江生物材料有限公司）；膠原蛋白溶液（北京科勞得生物制品技術開發(fā)有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（上海國藥集團化學試劑有限公司）；DG16探針（北京鑫興嘉業(yè)商貿有限公司）；玻璃離子（富士公司，日本）。VEGF兔多克隆抗體及BMP-2兔多克隆抗體（Abcam公司，英國）；ElivisionTMplus免疫組化試劑盒及DAB顯色劑（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）。

1.3 辛伐他汀-膠原蛋白復合海綿的制備

準確稱取25 mg辛伐他汀將其溶解在0.2 ml的無水乙醇中，然后加入濃度為0.2 mol／L的氫氧化鈉0.3 ml，在50℃下加熱2 h后，用1 N鹽酸中和到pH為7.2，用 PBS定容至1 ml，終濃度為60 mmol／L作為母液，4℃下儲存，使用前取母液1.67μl，加入到100 ml的膠原蛋白溶液中，磁力攪拌器下攪拌均勻，終濃度為1μmol／L，將攪拌均勻的混合液倒入六孔板中，并置于-80℃冰箱中冷凍12 h，隨后轉入到冷凍干燥機中在抽真空的狀態(tài)下冷凍干燥24 h，即得到辛伐他汀-膠原蛋白復合海綿。在無菌操作臺上將復合物剪成0.5 mm3的小塊，經60Co輻照滅菌處理后放于4℃冰箱中冷藏保存、備用。

1.4 實驗動物模型的建立

按3 ml／kg的劑量于大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，取仰臥位將其固定在手術臺上，3%過氧化氫和生理鹽水交替沖洗口腔，用0.5%的碘伏消毒口腔及其周圍組織，用1／4號球鉆在用水冷卻的條件下于左上頜第一磨牙的咬合面中央窩處間斷鉆磨，直至窩洞底透出粉紅色，隨后換用DG16探針輕輕穿髓，穿髓孔的直徑為0.35 mm，以見到輕微出血點作為穿髓成功的標準。生理鹽水沖洗窩洞，無菌小棉球除去多余水分。分別將制備好的氫氧化鈣、辛伐他汀-膠原蛋白復合海綿以及膠原蛋白海綿覆蓋于穿髓孔處，盡量不向髓腔方向加壓，嚴密封閉穿髓孔，玻璃離子充填，適當降低雙側下頜第一磨牙，整個實驗嚴格按照無菌操作進行。術后第1、3、7、14、28天各組隨機選取8只，采用心臟灌注的方法處死大鼠，迅速分離出含有第一磨牙的上頜骨，立即置于4%多聚甲醛中繼續(xù)體外固定48 h。

1.5 組織標本的制備及免疫組化染色

將固定好的標本放入10%的EDTA（pH＝7.4）溶液中，25℃恒溫下進行脫鈣，脫鈣時間為12周，流水沖洗12 h，去除玻璃離子，梯度乙醇脫水，正丁醇透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，制作平行于牙體長軸方向做近遠中向連續(xù)切片，厚度為4μm，用于免疫組化染色。采用Elivision方法進行免疫組化染色。所用VEGF抗體濃度為1∶600，BMP-2抗體濃度為1∶300，均設陽性及陰性對照。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6 結果判斷和圖像分析

結果判斷：VEGF陽性染色主要定位于細胞質或細胞膜中，而BMP-2陽性染色主要定位于細胞質中，呈清晰棕色或棕褐色為陽性。以染色深淺作為陽性強度的判定標準，強陽性、陽性、弱陽性、陰性表達分別為深棕黃色、棕黃色、淺黃色、無著色。

圖像分析：隨機選取通過穿髓孔且冠根完整的切片，每組各5張，在高倍鏡下，隨機選3個不重復的陽性區(qū)域，運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量其平均吸光度值（A值），并取均值，數據用表示。

1.7 統計學分析

應用SPSS 19.0軟件統計分析，對實驗數據進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，若資料服從正態(tài)分布且方差齊同，則對同一時間點不同處理組先進行單因素方差分析（one-factor ANOVA），若結果具有統計學差異，則進一步采用LSD-t檢驗進行兩兩分析；此外，各實驗組不同時間點與正常對照之間采用Dunnett-t檢驗，若資料非正態(tài)分布或（和）方差不齊則采用秩和檢驗。按α＝0.05水準，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 VEGF、BMP-2正常牙髓組織中的表達情況

在正常的牙髓組織中VEGF在血管內皮細胞中呈陽性表達，而牙髓細胞及成牙本質細胞則無表達。而BMP-2在正常的牙髓組織中均未出現表達，呈陰性表達（圖1）。

2.2 VEGF在實驗組牙髓組織中的表達情況

圖1 VEGF、BMP-2在正常牙髓組織中的表達情況Fig 1 VEGF and BMP-2 expression in normal dental pulp tissue

圖2 VEGF在實驗組牙髓組織中的表達情況 （×400）Fig 2 VEGF expression in experimental dental pulp tissue （×400）

圖2示，術后第1天：穿髓點下方血管輕度擴張，血管內皮細胞呈強陽性表達，成纖維細胞的胞質中出現著色呈陽性表達，中性粒細胞弱表達，成牙本質細胞則無表達。術后第3天：中性粒細胞及內皮細胞都呈強陽性表達，血管擴張、增生，成牙本質細胞呈陽性表達，成纖維細胞表達數量增多，呈強陽性表達。術后第7天：血管增生，內皮細胞呈強陽性表達，新分化的成牙本質樣細胞呈陽性表達，成纖維細胞增殖區(qū)呈陽性表達。術后第14天：血管內皮細胞和成纖維細胞表達減弱，呈陽性表達，成牙本質細胞弱陽性表達，新形成的修復性牙本質下方排列較為整齊的成牙本質樣細胞呈弱陽性表達。術后第28天：實驗組表達情況與正常對照組的相似，血管內皮細胞呈陽性表達，而成牙本質細胞及成纖維細胞均呈陰性表達。

2.3 BMP-2在實驗組牙髓組織中的表達情況

圖3示，術后第1天：穿髓孔周圍的血管內皮細胞呈強陽性表達，少量的成纖維細胞出現表達呈弱陽性，而成牙本質細胞則無表達。術后第3天：血管內皮細胞呈強陽性表達，成纖維細胞表達數量增加以及浸潤的中性粒細胞都呈陽性表達，成牙本質細胞開始表達呈弱陽性。術后第7天：穿髓孔下方及周圍的血管內皮細胞呈強陽性表達，成纖維細胞及成牙本質細胞強陽性表達且陽性細胞數量明顯增加，新生的成牙本質細胞樣細胞呈陽性表達。術后第14天：成牙本質細胞樣細胞以及兩側成牙本質細胞表達均有所減弱，血管內皮細胞及成纖維細胞呈陽性表達。術后第28天：牙髓組織恢復正常，基本檢測不到BMP-2的表達。

2.4 圖像分析統計結果

圖3 BMP-2在實驗組牙髓組織中的表達情況 （×400）Fig 3 BMP-2 expression in experimental dental pulp tissue （×400）

表1 3組蓋髓術后VEGF陽性染色A值 （）Tab 1 A value of VEGF positive staining of three direct pulp capping groups （）

表1 3組蓋髓術后VEGF陽性染色A值 （）Tab 1 A value of VEGF positive staining of three direct pulp capping groups （）

注：①與正常對照相比，P＜0.05；②與CS組相比，P＜0.05；③與CH組相比，P＜0.05

時間（d） CS組 CH組 SIM組1 0.014 93±0.001 65① 0.019 34±0.002 06①② 0.021 02±0.002 15①②.000 29 0.036 73±0.002 81① 0.049 58±0.003 30①② 0.066 39±0.003 53①②③7 0.025 15±0.003 02① 0.035 67±0.002 38①② 0.043 56±0.003 22①②③14 0.011 65±0.001 40① 0.012 83±0.001 18① 0.013 16±0.001 82①28 0.001 81±0.000 20 0.001 96±0.000 35 0.002 01±0.000 28正常對照 0.001 75±0.000 29 0.001 75±0.000 29 0.001 75±0 3

表2 3組蓋髓術后BMP-2陽性染色A值 （）Tab 2 A value of BMP-2 positive staining of three direct pulp capping groups （）

表2 3組蓋髓術后BMP-2陽性染色A值 （）Tab 2 A value of BMP-2 positive staining of three direct pulp capping groups （）

注：①與正常對照相比，P＜0.05；②與CS組相比，P＜0.05；③與CH組相比，P＜0.05

時間（d） CS組 CH組 SIM組1 0.005 27±0.000 95① 0.005 63±0.001 12① 0.006 01±0.000 99①.000 20 0.012 39±0.001 50① 0.017 38±0.002 52①② 0.021 81±0.001 94①②7 0.034 11±0.002 81① 0.046 58±0.003 22①② 0.064 59±0.003 88①②③14 0.024 93±0.003 02① 0.034 98±0.002 85①② 0.042 09±0.003 32①②③28 0.000 68±0.000 15 0.000 74±0.000 19 0.000 81±0.000 18正常對照 0.000 63±0.000 20 0.000 63±0.000 20 0.000 63±0 3

正常對照組及各實驗組蓋髓術后不同時間點，VEGF、BMP-2陽性染色的平均光密度值如表1～2。實驗組中VEGF、BMP-2的表達強度都呈現出先升高后降低的變化，VEGF在術后第3天達到峰值，而BMP-2在術后第7天達到最大值。統計結果表明，3組實驗組VEGF、BMP-2在術后第1、3、7、14天的表達水平要高于正常對照組（P＜0.05），但在術后第28天表達水平則無統計學意義（P＞0.05）。SIM組及CH組中VEGF的表達量在術后第1、3、7天顯著高于CS組，且差異具有統計學意義（P＜0.05），此外，與CH組相比，SIM組在術后第3、7天，VEGF的表達水平更高（P＜0.05）。術后第3、7、14天SIM組及CH組BMP-2的表達強度要高于CS組（P＜0.05），而SIM組與CH組則在術后第7、14天表達存在顯著差異，SIM組BMP-2表達要高于CH組（P＜0.05）。

3 討 論

血管生成是所有傷口愈合的關鍵步驟，同樣牙髓血管生成也是牙齒修復的前提條件［6］。血管生成是一個多步驟的動態(tài)過程，有眾多的細胞因子參與其中，而VEGF作為血管生成最為重要的調節(jié)因子之一，在血管的生成中具有重要的促進作用［7］。

研究發(fā)現，VEGF不僅能促進牙髓組織血管的形成，而且還參與了牙髓炎癥的發(fā)展以及牙髓組織損傷后修復的過程中［8］。本實驗研究結果表明在正常的牙髓組織中，VEGF有少量的表達，表明其可能參與了正常牙髓的生理過程。而且在直接蓋髓術后第1～14天，實驗組VEGF的表達水平均高于正常組，且VEGF表達陽性的細胞由起先血管內皮細胞到術后炎癥細胞、成纖維細胞、成牙本質細胞均表達陽性，同時這一時間范圍內是牙髓組織炎癥反應及損傷修復的過程，說明VEGF在這一過程中起著一定的作用。VEGF參與牙髓炎癥反應主要與其能上調基質金屬蛋白酶的活性、增加血管的通透性，以及促進中性粒細胞、單核巨噬細胞的游走、趨化、聚集于損傷的部位有關［9-10］。此外，VEGF還可通過誘導牙髓血管形成，為損傷組織提供充足的血供和營養(yǎng)物質，促進牙髓細胞增殖、成骨分化、提高ALP的表達水平參與牙髓的修復［11］。VEGF促進炎癥反應以及誘導牙髓血管生成、牙髓細胞增殖分化在一定程度上都有利于損傷牙髓的恢復。

本研究中，在蓋髓術后1～14 d，SIM組VEGF的表達量要高于CS組及CH組，可知辛伐他汀具有促進牙髓組織VEGF的表達，而且其促進VEGF的表達能力要強于氫氧化鈣。研究表明辛伐他汀能夠促進包括牙髓細胞在內的多種細胞VEGF mRNA的表達［12］，其促進牙髓細胞VEGF的表達可能與提高血紅素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）的表達水平有關［13］。研究發(fā)現其還能通過提高VEGF的表達水平來促進糖尿病患者傷口的愈合以及去卵巢大鼠種植體周圍骨組織的生成［14-15］。表明辛伐他汀可能通過提高牙髓組織VEGF的表達水平來促進受損牙髓組織的修復。

牙髓愈合的過程中，除了需要新生的血管為其提供氧氣和營養(yǎng)物質外，還需要有能夠促進修復性牙本質形成的細胞因子，而BMP-2在這一過程中起著重要的作用。早期的研究已證實BMP-2的表達從牙胚發(fā)育一直持續(xù)到成牙本質細胞分化完成；而且，在成牙本質細胞分泌的牙本質基質時BMP-2出現了表達上調［3］；此外，有學者將BMP-2應用于直接蓋髓術后，發(fā)現其可促進修復性牙本質形成［2］。這些都表明BMP-2在牙胚發(fā)育、成牙本質細胞分化以及牙本質形成方面扮演著十分重要的角色。

實驗結果顯示，蓋髓術后第7天，牙髓炎癥程度減輕、修復性牙本質開始形成時，BMP-2的表達達到了最大值，此時成牙本質細胞樣細胞、成纖維細胞、成牙本質細胞都呈強陽性表達，而這一陽性表達一直持續(xù)到完整的修復性牙本質形成，表明BMP-2在牙髓損傷修復階段能夠促進修復性牙本質的形成。在蓋髓術后1～14 d，SIM組BMP-2的表達強度要高于CS組，可知辛伐他汀-膠原蛋白復合海綿中促進牙髓損傷修復過程中BMP-2表達的主要成分是辛伐他汀。研究表明辛伐他汀在多種成骨細胞系及骨組織的愈合過程中均能提高BMP-2的表達水平［16］。其促進BMP-2的表達與其能抑制HMG-CoA還原酶和Rho（rhodostomin）相關激酶的活性，以及促進核結合因子al（core binding factors alpha 1，Cbfa1）的表達有關［17］。此外，在蓋髓術后1～14 d，CH組BMP-2的表達水平要低于SIM組，可能與氫氧化鈣的強堿性引起牙髓組織凝固壞死有關，研究表明將氫氧化鈣與大鼠牙髓細胞一起培養(yǎng)時，牙髓細胞BMP-2表達水平出現降低［18］，這也說明氫氧化鈣的細胞毒性影響了牙髓細胞BMP-2的表達。

綜上所述，辛伐他汀-膠原蛋白復合海綿促進牙髓組織愈合以及修復性牙本質的形成與其能顯著提高牙髓損傷修復的過程中VEGF及BMP-2的表達水平有關。