朱一帆，陳穎鈺，劉晗，索朗斯珠，牛家強(qiáng)，郭愛珍

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

牛結(jié)核病是一種慢性消耗性人畜共患病，牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis, M. bovis）是該病的主要病原菌，其次為主要感染人結(jié)核病的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, M. tb）。大量研究顯示，這兩種病原菌能夠在不同物種間相互傳播，導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生[1,2]。本實(shí)驗(yàn)室前期從一結(jié)核病牛體內(nèi)分離到一株結(jié)核分枝桿菌，命名為1458株。并通過動(dòng)物回復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證了該菌確實(shí)能夠?qū)εＶ虏　樯钊肓私庠撆Ｔ慈诵椭甑闹虏C(jī)制，為牛及人結(jié)核病的防控提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)室建立了基于該牛源人型株1458株的結(jié)核病感染模型，利用1458株成功感染了人巨噬細(xì)胞THP-1，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的MicroRNA（miRNA）進(jìn)行了分析。

miRNA是長(zhǎng)度僅為19～22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，主要通過與靶標(biāo)基因mRNA的3'非編碼區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控宿主細(xì)胞增殖、分化、凋亡、壞死、自噬及個(gè)體代謝發(fā)育等生命進(jìn)程[3～6]。研究表明，miRNAs在M. tb感染中通過抑制不同靶標(biāo)基因的表達(dá)，調(diào)控宿主巨噬細(xì)胞的自噬、凋亡和炎癥應(yīng)答等多種生物學(xué)過程，進(jìn)而影響M.tb的入侵和在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖，并可作為結(jié)核病潛在的診斷標(biāo)志和治療制劑靶位點(diǎn)[7～11]。

在1458株感染模型中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)感染有結(jié)核分枝桿菌時(shí)，miR-107表現(xiàn)為顯著下調(diào)。報(bào)道顯示，miR-107在細(xì)胞增殖、分化、侵襲、自噬和凋亡等調(diào)控中起重要作用，在腫瘤等疾病中也扮演著重要的角色[12～14]，但其在M.tb感染中的作用還未有報(bào)道。為了闡明miR-107在M.tb1458株感染中的作用及其相關(guān)機(jī)制，本研究構(gòu)建了M.tb1458株與THP-1細(xì)胞體外相互作用模型及THP-1細(xì)胞過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-107轉(zhuǎn)染模型，對(duì)miR-107在M.tb1458株與巨噬細(xì)胞相互作用中對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌及M.tb1458株對(duì)巨噬細(xì)胞侵襲的影響進(jìn)行了研究，一方面以該牛源人型株為感染模型闡明結(jié)核分枝桿菌的感染機(jī)制，另一方面也為人及動(dòng)物結(jié)核病的防控提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞、細(xì)菌及培養(yǎng)

人急性白血病單核細(xì)胞（THP-1，ATCC ? TIB-202TM）使用含有10%澳洲胎牛血清（Gibco）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone）于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；結(jié)核分枝桿菌牛源人型分離株1458株（M.tb，北京株，NZ_CP013475.1），由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存，使用含有10% OADC（BD）和0.05% Tween-80（Sigma）的7H9培養(yǎng)基（BD）于37℃培養(yǎng)，本試驗(yàn)中的M.tb1458株相關(guān)試驗(yàn)均在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（ABSL-3）內(nèi)嚴(yán)格按照生物安全相關(guān)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清、HBSS緩沖液購(gòu)自Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；異丙醇、吐溫-80、氯仿購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；7H9、7H11培養(yǎng)基、OADC增菌液購(gòu)自BD公司；hsa-miR-107化學(xué)模擬物、模擬物陰性對(duì)照、hsa-miR-107抑制劑和抑制劑陰性對(duì)照購(gòu)自蘇州吉瑪公司；轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin? 購(gòu)自Ployplus公司；TRizol購(gòu)自Invitrogen 公司；AceQ qPCR SYBR green master mix、HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix購(gòu)自Vazyme公司；All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit購(gòu)自GeneCopoeia公司；熒光定量相關(guān)引物（表1）由武漢昆泰銳公司合成。

表1 熒光定量相關(guān)引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染

THP-1細(xì)胞以5×105/孔的比例接種于12孔細(xì)胞板中，使用轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin?（8μL/孔）進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，miR-107化學(xué)模擬物、miR-107抑制劑、模擬物陰性對(duì)照和抑制劑陰性對(duì)照各15pg/孔，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h后加入佛波酯 （PMA，終濃度40ng/mL）誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞貼壁12h等待感染M. tb1458株。

1.2.2M.tb1458株感染

M.tb1458株培養(yǎng)20d至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取試驗(yàn)所需體積菌液于3 000g離心10min，棄上清，1/2離心體積的HBSS緩沖液重懸并使用胰島素注射器充分分散4～6次后靜置5min，細(xì)菌懸液的上半部分上層菌液用于后續(xù)感染。感染細(xì)菌數(shù)目根據(jù)OD600nm=0.6相當(dāng)于約1×108個(gè)細(xì)菌/mL計(jì)算[18]。同時(shí)將100μL懸浮液連續(xù)稀釋，并將每個(gè)梯度稀釋液50μL接種到含有10% OADC的Middlebrook 7H11瓊脂平板上，37℃條件下孵育14～21d計(jì)算活細(xì)菌數(shù)目（CFU/mL）。

感染時(shí)，取已測(cè)OD600nm上層菌液以MOI=10:1感染THP-1細(xì)胞12h，12h后使用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌兩遍，加入含慶大霉素（終濃度100μg/mL）和10% FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基去除胞外細(xì)菌（此時(shí)定義為0h），再于0h、6h、12h、24h后收集細(xì)胞樣本。

1.2.3 參與調(diào)控 miR-107表達(dá)的信號(hào)通路檢測(cè)已有文獻(xiàn)報(bào)道，NF-κB和MAPKs信號(hào)通路通過調(diào)控M. tb1458株感染的巨噬細(xì)胞中促炎或抑炎細(xì)胞因子的分泌介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中M.tb1458株的存活[19～21]。為了檢測(cè)這些信號(hào)通路是否參與調(diào)控M.tb1458株感染的THP-1細(xì)胞中miR-107的表達(dá)，本試驗(yàn)使用PI3K（10μmol/L，LY294002）、JNK（10μmol/L，PA600125）、P38（10μmol/L，SB203580）和NF-κB（20μmol/L，SC514）4個(gè)特異性信號(hào)通路抑制劑（Target Mol）分別處理PMA分化的THP-1細(xì)胞2h后如上1.2.2所述感染M.tb1458株，收集終止感染后12h的THP-1細(xì)胞樣本，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）檢測(cè)各組miR-107的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 THP-1細(xì)胞內(nèi)M. tb1458菌株計(jì)數(shù)

THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程同1.2.1，感染M.tb1458株過程同1.2.2。于0h，PBS洗滌兩遍后每孔加入500μL去離子水，室溫裂解細(xì)胞15min，分散混勻后用HBSS緩沖液梯度稀釋至10-3，取100μL涂布于Middlebrook 7H11瓊脂平板，37℃溫箱倒置培養(yǎng)3周后計(jì)數(shù)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 THP-1細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

TRIzol（Invitrogen）法提取THP-1細(xì)胞的總RNA。用polyA加尾法（All-in-OneTMmiRNA qRTPCR Detection Kit，GeneCopoeia）進(jìn)行miR反轉(zhuǎn)錄。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用SYBR Green 染料法對(duì)miR-107的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證，如下程序進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min；95℃、10s；60℃、30s，共40個(gè)循環(huán)；95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s，收集溶解曲線信號(hào)。miRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)的內(nèi)參基因是U6，目的基因相對(duì)表達(dá)的定量分析采用2-ΔΔCt法（Livak），該分析的前提是假設(shè)每一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)增加1倍的目的基因數(shù)量，使用PCR反應(yīng)的指數(shù)期所獲取的Ct值來反映模板量的大小，Ct值相差1等于起始模板量2倍的差異。樣品中靶基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=目的基因ΔCt值-內(nèi)參基因ΔCt值。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件GraphPad Prism 7.0計(jì)算各組數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，各組數(shù)據(jù)以means±SEM表示，并用Student's t test 、One-way、Two-way ANOVA檢驗(yàn)分析各組數(shù)據(jù)的均數(shù)差異顯著性。P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001分別用＊、 ＊＊、 ＊＊＊ 表示。

2 結(jié)果

2.1 M. tb 1458株顯著下調(diào)miR-107在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)室前期通過R N A 高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，M.tb1458株感染巨噬細(xì)胞系THP-1后，miR-107顯著下調(diào)表達(dá)。通過qRT-PCR驗(yàn)證M.tb1458株、熱滅活M.tb1458株（HI-M. tb 1458株）和PBS（對(duì)照，定義為1）分別處理的THP-1細(xì)胞中的miR-107表達(dá)量如圖1所示。THP-1細(xì)胞感染MTB后miR-107在感染后6h、12h、24h均顯著下調(diào)表達(dá)（P＜0.001），相比較熱滅活的M.tb1458株處理組，M.tb1458株處理組能夠誘導(dǎo)miR-107更為顯著的下調(diào)表達(dá)（感染后6h和24h，P＜0.01）。結(jié)果表明，M.tb1458株顯著下調(diào)THP-1細(xì)胞中miR-107的表達(dá)，M.tb1458株在巨噬細(xì)胞內(nèi)分泌的多種蛋白可能參與調(diào)節(jié)miR-107的下調(diào)表達(dá)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-107在MTB和巨噬細(xì)胞互作中的表達(dá)量

2.2 PI3K信號(hào)通路參與調(diào)控M.tb1458株感染誘導(dǎo)的miR-107下調(diào)表達(dá)

為了檢測(cè)M.tb1458株感染中有哪些信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)miR-107的下調(diào)表達(dá)，分別使用PI3K（10μmol/L，LY294002）、JNK（10μmol/L，PA600125）、p38（10μmol/L SB203580）和NF-κB（20μmol/L，SC514）4個(gè)特異性信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理PMA分化的THP-1細(xì)胞后感染M.tb1458株，通過qRT-PCR檢測(cè)miR-107的表達(dá)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比JNK、p38和NF-κB信號(hào)通路，當(dāng)PI3K信號(hào)通路被抑制后，miR-107下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)被明顯抑制（P＜0.05），且與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05），表明PI3K信號(hào)通路參與調(diào)控M.tb1458株誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中miR-107的下調(diào)表達(dá)（圖2）。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)參與調(diào)節(jié)M. tb 1458株感染的THP-1細(xì)胞中miR-107表達(dá)的信號(hào)通路

2.3 miR-107負(fù)向調(diào)控M. tb 1458株誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá)

外源性添加miR-107模擬物和miR-107抑制劑后，通過qRT-PCR對(duì)M.tb1458株感染的THP-1細(xì)胞中IL-1β、IL-10、TNF-α和IL-6的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，與對(duì)照組相比，miR-107模擬物處理組可顯著抑制IL-1β（P＜0.05）、IL-10（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.05）和IL-6（P＜0.01）mRNA水平的表達(dá)；與之相反，miR-107抑制劑處理組可顯著促進(jìn)IL-1β（P＜0.05）、IL-10（P＜0.05）、TNF-α（P＜0.01）和IL-6（P＜0.001）mRNA水平的表達(dá)。表明miR-107負(fù)向調(diào)控M.tb1458株誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá)。

圖3 miR-107模擬物抑制M.tb1458株誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)A:IL-1β檢測(cè); B:IL-10檢測(cè); C:TNF-α檢測(cè); D:IL-6檢測(cè)

2.4 miR-107 抑制劑抑制M. tb 1458株對(duì)THP-1細(xì)胞的入侵

為了探究miR-107 對(duì)M.tb1458株侵襲能力的影響，THP-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-107模擬物、miR-107 抑制劑、模擬物陰性對(duì)照或抑制劑陰性對(duì)照后感染M.tb1458株，通過CFU實(shí)驗(yàn)對(duì)M.tb1458株對(duì)THP-1細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，相比較對(duì)照組，miR-107模擬物顯著促進(jìn)M.tb1458株對(duì)THP-1細(xì)胞的入侵（P＜0.001）。同時(shí)，抑制miR-107后M.tb1458株對(duì)THP-1細(xì)胞的入侵明顯受到了抑制（P＜0.001）（圖4）。

圖4 miR-107對(duì) M.tb1458株侵襲的影響

3 討論

結(jié)核分枝桿菌是一種能在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖的病原體，主要在人間傳播。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)其對(duì)牛也有致病性，并成功在發(fā)病牛體內(nèi)結(jié)核病灶中分離出結(jié)核分枝桿菌[2]。結(jié)核分枝桿菌與宿主協(xié)同進(jìn)化，一方面結(jié)核分枝桿菌通過逃避宿主先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，以在宿主細(xì)胞（主要是巨噬細(xì)胞）的惡劣微環(huán)境中持續(xù)存活[22～25]，另一方面，巨噬細(xì)胞能夠通過自噬、凋亡和炎癥應(yīng)答等多種生物學(xué)過程抵御結(jié)核分枝桿菌感染入侵[22,26]。miRNA是免疫應(yīng)答的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，據(jù)報(bào)道，M.tb感染期間，至少有30種miRNA在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞中差異表達(dá)[27]。他們通過介導(dǎo)自噬、細(xì)胞凋亡、吞噬和NF-κB等先天免疫信號(hào)通路的激活來調(diào)節(jié)宿主對(duì)M.tb感染的免疫反應(yīng)[10,28～30]。然而，目前還未有關(guān)于miR-107在M.tb感染中作用的報(bào)道。

本研究首次證明了M.tb1458株感染可顯著下調(diào)THP-1細(xì)胞中miR-107的表達(dá)，并依賴于PI3K信號(hào)通路；進(jìn)一步確定了miR-107抑制劑能夠促進(jìn)M.tb1458株誘導(dǎo)的IL-1β、IL-10、TNF-α和IL-6 mRNA水平表達(dá)，并抑制了M.tb1458株對(duì)THP-1細(xì)胞的入侵。表明M.tb1458株感染中，巨噬細(xì)胞可通過下調(diào)表達(dá)miR-107促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的分泌以募集周圍的巨噬細(xì)胞抑制M.tb1458株的入侵，但其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

已有研究報(bào)道，M.tb感染中miRNAs通過調(diào)控不同靶標(biāo)基因的表達(dá)，影響宿主巨噬細(xì)胞的自噬、凋亡和炎癥應(yīng)答等多種生物學(xué)過程[7～10]。因此，進(jìn)一步鑒定miR-107的下游靶標(biāo)基因有助于揭示miRNA-107 負(fù)向調(diào)控M.tb1458株感染誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答和促進(jìn)M.tb1458株入侵的分子機(jī)制。本研究通過在線算法預(yù)測(cè)軟件對(duì)miRNA-107的下游靶基因進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，對(duì)4個(gè)軟件均能預(yù)測(cè)到的102個(gè)靶標(biāo)基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-107的下游靶基因主要聚類到與細(xì)胞分化、泛素化和DNA損傷修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路中，揭示miR-107在M.tb1458株和巨噬細(xì)胞互作中可能通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)蛋白的泛素化進(jìn)程來調(diào)控炎癥反應(yīng)、影響M.tb1458株的入侵，不過這需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。