張曉妹，葛紹陽，桑躍，劉治麟

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心，廊坊 065201；3.北京和益源生物技術(shù)有限公司，北京 100089）

益生菌是一種活的微生物，當(dāng)攝入達(dá)一定量時能夠?qū)θ梭w健康起到促進(jìn)作用。其形態(tài)學(xué)、生化特性、生理功能和臨床應(yīng)用的研究已經(jīng)受到人們的廣泛認(rèn)可[1]。近年來，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，人們對乳酸菌在人類健康及疾病中的作用有了更加全面及深入的認(rèn)識，多種益生菌的生理活性功能得到開發(fā)利用，益生機(jī)制得到了深入的研究，包括改善腸道炎癥[2]、免疫調(diào)節(jié)、脂代謝調(diào)節(jié)[3,4]、預(yù)防過敏性疾病[5]等。

乳酸菌已經(jīng)有較長的應(yīng)用歷史，長期以來乳酸菌被人們應(yīng)用于酸奶發(fā)酵工藝中。另外，在天然發(fā)酵奶油的基礎(chǔ)上，結(jié)合乳酸菌的發(fā)酵方式可以得到人工發(fā)酵奶油。干酪作為食品已有9 000年歷史了，干酪的制作過程也是利用乳酸菌對乳酪蛋白進(jìn)行固化和壓縮處理。因此，在長期的應(yīng)用過程中許多乳酸菌及其產(chǎn)品被公認(rèn)是相對安全的。但是與此同時一些潛在的安全問題是不容忽視的，人們對乳酸菌安全性的認(rèn)識仍然不足。Gasser[6]在1994年的報(bào)道中稱乳酸菌引起的心肌膜炎占0.05%～0.4%，而鏈球菌-葡萄球菌引起的心肌膜炎比例高達(dá)79.3%。Donohue等[7]認(rèn)為乳酸菌中大多數(shù)乳桿菌是安全的，而鏈球菌和腸球菌屬的某些菌株為條件致病菌。

目前國際上對乳酸菌安全性的關(guān)注主要在以下幾方面：①感染能力。雖然大多數(shù)乳酸菌在長期使用過程中被認(rèn)為是 “相對安全” 的，但已有相關(guān)報(bào)道指出乳桿菌、腸球菌等乳酸菌的攝入會引起菌血癥、心內(nèi)膜炎感染等疾病[8]。②產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物。在正常人的腸道中，腸道菌具有的氨基脫羧酶活性可將游離的氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺類物質(zhì)，而過量生物胺類能夠引起惡心、嘔吐、發(fā)燒等食物中毒的癥狀。③耐藥性及攜帶耐藥基因?？赡褪芸股氐娜樗峋鷷置诰哂薪到饪股刈饔玫拿?，也可能會把耐藥基因轉(zhuǎn)移給其他細(xì)菌。因此，有必要對益生菌進(jìn)行以上的安全性評價(jià)。

1 材料和方法

1.1 菌株

長雙歧桿菌BB68S，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC No. 14168，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品實(shí)驗(yàn)室提供。金黃色葡萄球菌ATCC 25923，購自中國普通微生物保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

脫羧酶培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g、酵母粉5g、牛肉膏5g、氯化鈉2.5g、葡萄糖0.5g、吐溫80 1g、MnSO40.5g、MgSO40.2g、FeSO40.04g、硫胺素0.01g、K2HPO42g、CaCO30.1g、溴甲酚0.06g、5’-磷酸吡哆醛0.05g、前體氨基酸5g，加去離子水至1L，調(diào)pH值至5.3～5.5，115℃滅菌20min。

MRS瓊脂培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，購自北京陸橋生物技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 抗生素敏感性檢測

采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法。BB68S和金黃色葡萄球菌ATCC 25923分別接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，待表面干燥后把抗生素紙片放置在上面，37℃培養(yǎng)24h后，測定抑菌圈大小。

1.3.2 生物胺檢測

待測菌株在MRS培養(yǎng)基中活化2次；在含0.1%前體氨基酸（酪氨酸、組氨酸、精氨酸、鳥氨酸）和0.005%磷酸吡哆醛-5-磷酸的MRS培養(yǎng)基中傳代5次（以此誘導(dǎo)脫羧酶）；將活化菌株接入脫羧酶培養(yǎng)基，培養(yǎng)4d，觀察培養(yǎng)基顏色及測定培養(yǎng)基pH值，取樣進(jìn)行衍生，測定生物胺[9]。

1.3.3 動物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

SPF級Balb/C小鼠，6～8周齡，雌性。飼養(yǎng)于SPF級動物房：溫度22±2℃，相對濕度55%±2%，12h燈照/黑暗循環(huán)，自由飲水和攝食。將小鼠隨機(jī)分為4組（每組10只）：灌胃組（3個組），分別以每天5×108cfu/鼠、5×109cfu/鼠和5×1010cfu/鼠BB68S劑量灌胃28d（每只小鼠每天0.2mL）；對照組，用生理鹽水灌胃。試驗(yàn)期間每天觀察小鼠的一般表觀、中毒表現(xiàn)和死亡情況，每周記錄小鼠的體重、攝食量。

1.3.4 血生化和血常規(guī)指標(biāo)檢測

取小鼠全血用全自動血液分析儀（ H i t a c h i , Japan）檢測血常規(guī)項(xiàng)目，包括：紅細(xì)胞（RBC）、血小板、 血細(xì)胞壓積（ H C T ）、 平均紅細(xì)胞體積（MCV）、血紅蛋白、平均血紅蛋白濃度（MCHC）。全血離心取血清，用全自動生化分析儀檢測生化項(xiàng)目，包括：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GRT）、總蛋白（TP）、白蛋白、血糖（GLU）、膽固醇。

1.3.5 細(xì)菌移位能力評價(jià)

分析小鼠血、肝臟、脾臟及腎臟的細(xì)菌移位情況。將50μL小鼠血涂布于MRS平板及BHI平板，于37℃下分別厭氧及有氧培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。取組織樣品，以1g/mL懸滴于無菌生理鹽水中，勻漿后取100μL分別涂布于MRS平板及BHI平板，按血樣同樣方法培養(yǎng)，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。有菌落生長即記為陽性。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同處理方法之間均值比較采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，不同處理之間移位率比較采用卡方檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素敏感性

已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌以及植物乳桿菌等乳酸菌天然對糖肽類抗生素如萬古霉素具有普遍耐受性。表1結(jié)果表明，BB68S對氨基糖苷類、喹諾酮類、糖肽類部分抗生素及氨曲南的敏感性為R或者I，這與文獻(xiàn)報(bào)道的氨基糖苷類、喹諾酮類抗生素及胺曲南對革蘭氏陽性菌效果普遍較差相符。從檢測范圍分析，菌株BB68S不存在種屬保守耐性以外的抗生素耐受性。菌株的這種固有耐性多為菌株縱向遺傳獲得，而非基因橫向轉(zhuǎn)移，耐性的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)小。

2.2 生物胺檢測

脫羧酶培養(yǎng)基中溴甲酚紫的有效指示范圍為pH 5.2～6.8，pH值在5.5時呈黃色，稍大于5.5就會出現(xiàn)顏色變化，呈現(xiàn)紫色或紫紅色。BB68S在改良脫羧酶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4d，相對于空白對照培養(yǎng)基，添加了鳥氨酸、組氨酸、酪氨酸及精氨酸這四種不同氨基酸的液體培養(yǎng)基均呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明乳酸菌在其中可以正常生長，而各培養(yǎng)基均呈黃色，表明菌株生長并未導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值升高，初步判斷菌株未產(chǎn)生胺類物質(zhì)。

表1 試驗(yàn)菌株藥物敏感性能

2.3 口服BB68S急性毒性試驗(yàn)

血常規(guī)指標(biāo)異常可反映試驗(yàn)菌株在血液中的副作用，血生化指標(biāo)異?？煞从碃I養(yǎng)不足及代謝失衡的狀況，這些指標(biāo)的變化通常早于其他的臨床癥狀。表2結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和對照組血常規(guī)和血生化指標(biāo)未發(fā)生任何顯著變化，說明試驗(yàn)菌株對試驗(yàn)動物無不利影響。

表2 經(jīng)口灌胃組血常規(guī)指標(biāo)（n=10）

2.4 細(xì)菌移位檢測

細(xì)菌移位是益生菌安全性的最嚴(yán)重問題之一。益生菌移位可能引發(fā)感染，包括菌血癥、敗血癥或心內(nèi)膜炎等[10,11]。因此，評價(jià)益生菌的移位能力是十分重要的。表3結(jié)果表明，對照組和試驗(yàn)組的組織和血液樣本經(jīng)過培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基上無菌落生長，表明試驗(yàn)動物的組織和血液沒有受到污染，菌株沒有從腸道轉(zhuǎn)移到組織和血液中，未發(fā)生移位現(xiàn)象。

表3 經(jīng)口灌胃組小鼠被試菌轉(zhuǎn)移到肝、脾、腎和血液的移位率

3 結(jié)論

長雙歧桿菌BB68S不存在種屬特有耐性以外的抗生素耐受性，不存在抗生素轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)；產(chǎn)胺試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)生物胺的產(chǎn)生。口服不同劑量試驗(yàn)菌（108cfu/鼠、109cfu/鼠、1010cfu/鼠），小鼠均未發(fā)生不良反應(yīng)，試驗(yàn)菌未發(fā)生血液、肝臟、脾臟和腎臟的移位，表現(xiàn)出較高的移位安全性。長雙歧桿菌BB68S安全性評價(jià)未發(fā)現(xiàn)菌株的不安全因素。