王 敏，劉修恒，陳志遠(yuǎn)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是老年男性發(fā)病率極高的惡性腫瘤。在我國(guó)，PCa的發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病率高居男性惡性腫瘤的第6位，而病死率居男性惡性腫瘤的第9位，在男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中其發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)膀胱癌和腎癌，位居第1[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，是介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要機(jī)制[2-3]。在前列腺癌中，EMT參與雄激素信號(hào)軸的調(diào)控[4]，并增加前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，參與前列腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程[5]。E-鈣黏素(E-cadherin)表達(dá)的丟失同N-鈣黏素(N-cadherin)和α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的高表達(dá)是EMT的標(biāo)志。賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine-specific demethylase 1，LSD1)是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶[6]，其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，它的表達(dá)增加與神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等諸多腫瘤相關(guān)[7-9]。LSD1同組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)、REST輔助抑制因子(CoREST)和Snail等輔助因子形成功能復(fù)合體，能夠催化組蛋白H3第4位賴氨酸二甲基和一甲基化(histone H3 dimethyl Lys4，H3K4me1、me2)的去甲基化，抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)EMT過(guò)程[10]。LSD1不僅參與雄激素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，還參與調(diào)節(jié)EMT過(guò)程，因此，我們推測(cè)LSD1在前列腺癌細(xì)胞中可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程，來(lái)介導(dǎo)前列腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。本文初步探討LSD1與前列腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程之間的關(guān)系，試圖為臨床治療前列腺癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集2006年1月至2008年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院接受前列腺癌根治術(shù)的前列腺癌患者標(biāo)本46例，其中15例為低Gleason評(píng)分(4～7分)、31例為高Gleason評(píng)分(8～10分)。另收集診斷為良性前列腺增生并接受經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)患者的標(biāo)本25例。

1.2 試劑及抗體前列腺癌LNCaP細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，SYBR Green I PCR試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司，LSD1小鼠抗人抗體和E-cadherin小鼠抗人抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司，N-cadherin兔抗人抗體和α-SMA兔抗人抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，羊抗鼠IgG二抗和羊抗兔IgG二抗購(gòu)自北京博奧森公司，ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。LSD1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，LSD1siRNA購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化檢測(cè) 組織切片用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2滅活細(xì)胞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用血清封閉，根據(jù)測(cè)試指標(biāo)滴加LSD1抗體以及相應(yīng)生物素化二抗，DAB顯色，封片。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組：轉(zhuǎn)染LSDl過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的LNCaP細(xì)胞組 (過(guò)表達(dá)組)、轉(zhuǎn)染LSD1siRNA的LNCaP細(xì)胞組 (干擾組)和正常的LNCaP細(xì)胞組(空白對(duì)照組)。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒空載體和siRNA空載體的LNCaP與正常的LNCaP細(xì)胞的各項(xiàng)基因表達(dá)無(wú)明顯差異。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)條件是含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5%CO2、95%空氣(體積分?jǐn)?shù))、37 ℃，硫酸銅溶液保持培養(yǎng)箱內(nèi)濕度并滅菌，每3～4 d更換培養(yǎng)液1次。

1.3.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和目的基因檢測(cè) 轉(zhuǎn)染步驟參見(jiàn)Lipofectamine 2000操作說(shuō)明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞，用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)LSDl表達(dá)情況：采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度和濃度后，取2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。采用PCR試劑盒定量檢測(cè)LSDl和內(nèi)參Actin表達(dá)。引物信息如下：LSD-1，F(xiàn)：5-GCCCAAAGAAACTGTGGTGTC-3，R：5-TGTGGCTGGGTAGTTACGGAT-3；Actin，F(xiàn)：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3，R：5-CCAGTTTTTAAATC-CTGAGTCAAGC-3。

1.3.5Matrigel遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 將無(wú)或有包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室放人24孔培養(yǎng)板孔中，上層加入200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基單細(xì)胞懸液(含1 ×103個(gè)細(xì)胞)，下室加入800 μL含10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))培養(yǎng)基，常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h。用濕潤(rùn)的棉簽去除小室上層的基質(zhì)膠和細(xì)胞，4%多聚甲醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù))固定20 min，PBS漂洗3次，0.1%結(jié)晶紫(質(zhì)量分?jǐn)?shù))染色5 min，PBS漂洗3次。取下Transwell小室置于載玻片上，倒置顯微鏡下觀察，任意選取5個(gè)視野(×200)計(jì)數(shù)，拍照。

1.3.6Western blot分析 提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)蛋白含量，分裝后于-70 ℃冰箱保存。取上述蛋白 (約40 μg)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳[SDS-PAGE，10%分離膠(質(zhì)量分?jǐn)?shù))]，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉、洗脫后分別加入LSDl小鼠抗人抗體(1∶1 000)，E-cadherin小鼠抗人抗體(1∶800)、N-cadherin兔抗人抗體(1∶1 000)和α-SMA兔抗人抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后以相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，并以小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶2 000)作為上樣對(duì)照。用ECL，暗室X光膠片曝光。

2 結(jié) 果

2.1 LSD1在良性前列腺增生組織和前列腺癌組織中的表達(dá)水平我們前期研究發(fā)現(xiàn)，LSD1主要在正常前列腺上皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞核表達(dá)[11]。一方面，LSD1在前列腺癌組織內(nèi)高表達(dá)，顯著高于良性前列腺增生組織；另一方面，其在高Gleason評(píng)分的前列腺癌組織中表達(dá)顯著高于低Gleason評(píng)分的前列腺癌組織(圖1)。

圖1 免疫組化檢測(cè)LSD1在良性前列腺增生組織和前列腺癌組織中的表達(dá)水平(×400)

A：良性前列腺增生組織；B：低Gleason評(píng)分前列腺癌組織；C：高Gleason評(píng)分前列腺癌組織。

2.2 LSDl在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)水平PCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組LSDl基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；干擾組LSDl基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。這說(shuō)明通過(guò)轉(zhuǎn)染LSD1基因質(zhì)?？梢燥@著上調(diào)LNCaP細(xì)胞的LSD1基因表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)染LSD1siRNA可以顯著下調(diào)LNCaP細(xì)胞的LSD1基因表達(dá)水平(圖2)。

2.3 LSDl影響LNCaP細(xì)胞的遷移和侵襲能力同步化處理過(guò)表達(dá)組、空白對(duì)照組和干擾組LNCaP細(xì)胞后，以Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)顯著多于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)，而干擾組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)顯著少于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)；同時(shí)，以包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)顯著多于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，而干擾組穿過(guò)細(xì)胞數(shù)顯著少于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。這表明上調(diào)LSDl基因表達(dá)可以增加前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而抑制LSDl基因表達(dá)能夠減弱前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖3)。

2.4 LSDl促進(jìn)LNCaP細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化Western blot分析結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組LSDl蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 3)；干擾組LSDl蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。過(guò)表達(dá)組細(xì)胞N-cadherin(P=0.002)和α-SMA(P=0.006)的表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，而E-cadherin(P<0.001)的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，干擾組細(xì)胞N-cadherin和α-SMA的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組(P均<0.001),而E-cadherin的表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。這說(shuō)明上調(diào)LSDl基因表達(dá)顯著增加N-cadherin和α-SMA的表達(dá)，并顯著降低E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；而下調(diào)LSDl基因表達(dá)則能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(圖4)。

圖2 PCR鑒定各組LSD1基因的mRNA表達(dá)水平

A：PCR結(jié)果顯示LSD1mRNA在過(guò)表達(dá)組表達(dá)明顯上調(diào)，而在干擾組中的表達(dá)明顯下調(diào)；B：LSD1mRNA在對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組和干擾組中擴(kuò)增倍數(shù)的比較。

圖3 各組細(xì)胞Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

圖4 Western blot分析各組LSDl、α-SMA、N-cadherin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平

3 討 論

組蛋白甲基化在表觀遺傳中發(fā)揮著十分重要的作用，在2004年LSD1首次被發(fā)現(xiàn)以前，組蛋白甲基化一直被認(rèn)為是不可逆的[6]。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(histonemethyl transferase，HMT)使組蛋白發(fā)生甲基化修飾，LSD1是組蛋白去甲基化酶。多項(xiàng)研究表明，LSD1對(duì)于維持腫瘤的生物學(xué)特性發(fā)揮了重要作用，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、增殖和凋亡等多種行為關(guān)系密切[7-8，12-14]。

ZHENG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，使用siRNA或抑制劑抑制LSD1功能能夠誘導(dǎo)某些表達(dá)異常的基因沉默，從而有效治療癌癥。HAN等[16]報(bào)道，聯(lián)合使用LSD1抑制劑和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMTs) 抑制劑，能夠明顯抑制膀胱癌、白血病和結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，LSD1在前列腺癌中的表達(dá)顯著高于良性前列腺增生組織，并且在高Gleason評(píng)分的前列腺癌組織中的表達(dá)顯著高于低Gleason評(píng)分的前列腺癌組織。因此，我們推測(cè)LSD1可能跟前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

上皮細(xì)胞通過(guò)一系列機(jī)制再分化為間質(zhì)細(xì)胞，這一過(guò)程被稱為EMT[17]。在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，EMT被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞潛能、治療抵抗和轉(zhuǎn)移進(jìn)展等惡性潛能相關(guān)[18-19]。同時(shí)，EMT被認(rèn)為在前列腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著非常重要的作用[20]。E-cadherin的丟失被認(rèn)為是EMT的標(biāo)志性改變，與腫瘤獲得侵襲性和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[21-22]。近年來(lái)，EMT在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中的作用已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌LNCaP細(xì)胞中通過(guò)過(guò)表達(dá)的方法上調(diào)LSD1表達(dá)，能夠增加LNCaP細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時(shí)，能夠顯著降低EMT標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)、并增加間質(zhì)表型N-cadherin和α-SMA的表達(dá)；而在前列腺癌LNCaP細(xì)胞中通過(guò)siRNA干擾的方法抑制LSD1表達(dá)，能夠降低LNCaP細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時(shí)，能夠顯著增加EMT標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)、并減少間質(zhì)表型N-cadherin和α-SMA的表達(dá)。LSD1主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，一方面它可以作用于H3K4，使單甲基化和雙甲基化的H3K4去甲基化，從而抑制相關(guān)基因的表達(dá)；另一方面，它可以作用于H3K9，使單甲基化和雙甲基化的H3K9去甲基化，從而激活相關(guān)基因的表達(dá)。說(shuō)明LSD1能夠增加前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力、促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，可能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT過(guò)程促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移。研究顯示，在Snail 誘導(dǎo)發(fā)生的EMT過(guò)程中，Snail能夠通過(guò)招募LSD1，沉默上皮細(xì)胞基因E-cadherin的表達(dá)[10]。Snail 包含1個(gè)Snag 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有豐富的精氨酸和賴氨酸殘基，類似于組蛋白H3的N末端尾部序列，從而使得Snail 能夠借助Snag結(jié)構(gòu)域?qū)SD1 鉤住，同時(shí)還能夠招募HDAC 和CoREST 輔助抑制因子等，與E-cadherin 啟動(dòng)子區(qū)域形成功能復(fù)合體，催化H3K4me1、me2 的去甲基化，從而抑制E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄。因此，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，過(guò)表達(dá)的LSD1可能以功能復(fù)合體的形式催化前列腺癌細(xì)胞H3K4me1、me2 的去甲基化，導(dǎo)致E-cadherin基因表達(dá)的降低以及N-cadherin和α-SMA基因表達(dá)的增加，從而促進(jìn)EMT過(guò)程。

因此，我們推測(cè)LSD1高表達(dá)可能成為判斷前列腺癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的一個(gè)標(biāo)志，前列腺癌細(xì)胞可能通過(guò)高表達(dá)LSD1，促進(jìn)EMT發(fā)生，使腫瘤細(xì)胞更具有侵襲和轉(zhuǎn)移性，從而利于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。LSD1有可能成為一個(gè)治療前列腺癌的新型抗癌靶點(diǎn)。