紀(jì)鳳娣，魯 緋，陶匯源，穆曉婷，李 東，夏 蓉,*

（1.北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

傳統(tǒng)的中國(guó)醋，也叫谷物醋，是中國(guó)人日常生活中重要的調(diào)味料，有3 000多年的悠久歷史。近十多年來(lái)，有報(bào)道稱醋有多種生理作用，如調(diào)節(jié)血糖和血壓、助消化、刺激食欲和促進(jìn)鈣的吸收[1]。中國(guó)有四大著名的中式谷物醋，分別為山西陳醋、鎮(zhèn)江香醋、四川麩皮醋和福建紅曲醋。其中，鎮(zhèn)江香醋以糯米為原料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵而成，以其獨(dú)特的風(fēng)味、悠久的生產(chǎn)歷史、豐富的產(chǎn)量和獨(dú)特的發(fā)酵工藝而備受推崇[2]。

四甲基吡嗪（又名川芎嗪）（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TMP），是中藥川芎中一種重要的生物活性物質(zhì)[3]。TMP具有藥理作用，被認(rèn)為是治療心腦血管疾病的有效藥物[4]。研究證明TMP也是醋等許多發(fā)酵食品和飲料中檢測(cè)到的一種主要的吡嗪類化合物[4]，其主要由釀造過(guò)程中的微生物代謝和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，是一種健康風(fēng)味成分，這是食醋的保健作用的依據(jù)。此外，TMP具有類似于炒堅(jiān)果和烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對(duì)其他香味有顯著的烘托和疊加作用，通常也被認(rèn)為是一種安全的物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，作為呈堅(jiān)果味和烤面包口味的食品配料成分[5-6]。

由于TMP是在食醋發(fā)酵過(guò)程中形成的化合物，因此可作為發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要指標(biāo)，是優(yōu)化整個(gè)食醋生產(chǎn)的有效參數(shù)之一。近年來(lái)，人們對(duì)TMP的研究，以及對(duì)其他揮發(fā)性組分的研究，傳統(tǒng)上都是通過(guò)溶劑萃取[7-9]、蒸汽蒸餾[7-9]、超臨界流體萃取[10]或頂空固相微萃取[7,9,11-13]以及隨后的氣相色譜[14-15]或氣相色譜-質(zhì)譜[9-13,16-18]分析進(jìn)行。液相色譜法[19-23]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[24-27]在TMP的分析測(cè)定中也有應(yīng)用，主要涉及中藥川芎及其制品[17-21]、生物樣品[20-22,24-27]和食品等[23,28-29]。相比液相色譜，在采用氣相色譜的分析測(cè)定中，樣品的前處理過(guò)程比較繁瑣，重復(fù)性相對(duì)較差，因此，對(duì)TMP的分析采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法，特別是超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法具有一定的優(yōu)勢(shì)。

本研究建立測(cè)定鎮(zhèn)江香醋及其相關(guān)產(chǎn)品中TMP含量的UPLC和HPLC分析方法，可以作為監(jiān)控食醋生產(chǎn)過(guò)程和相關(guān)產(chǎn)品中TMP參數(shù)的技術(shù)手段和理論依據(jù)，對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)和消費(fèi)具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎮(zhèn)江香醋及相關(guān)產(chǎn)品由江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司提供。

四甲基吡嗪（純度≥98%） 北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜級(jí)） 美國(guó)Fisher Chemical公司；三氟乙酸（色譜級(jí)） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇、乙酸（均為分析純） 北京化工廠；氫氧化鈉（分析純） 西隴化工股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Accucore Vanquish系列UPLC儀（含高壓二元體系泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector，DAD）和Chromeleon 7.2 SR4色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)等）美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；FE28 pH計(jì)瑞士Mettler Toledo公司；CF16RX高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；MX-F渦旋混合器 北京聯(lián)合科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取香醋等樣品1 g，加水至5 mL，渦旋混勻后置于冰浴中冷卻，用氫氧化鈉固體顆粒調(diào)節(jié)其pH值為8.5左右，加入提取液（5%乙酸＋15%水＋80%乙醇）25 mL，混勻后在25～30 ℃水浴中超聲提取30 min；10 000 r/min離心10 min，用滴管將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，室溫下用上述提取液定容至刻度，混勻后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待用。

精密稱取TMP標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL作為儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存，臨用前進(jìn)行系列稀釋。

1.3.2 色譜條件

UPLC條件：Accucore Vanquish C18＋色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)297 nm；流動(dòng)相：甲醇和pH值為2.4的酸溶液（含1%的乙酸和0.05%的三氟乙酸）（25∶75，V/V）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL。根據(jù)保留時(shí)間（配合紫外光譜）定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。

H P L C條件：Z O R B A X S B-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)297 nm；流動(dòng)相：甲醇和pH值為2.4的酸溶液（含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）（25∶75，V/V）；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL。根據(jù)保留時(shí)間（配合紫外光譜）定性化合物，使用外標(biāo)法根據(jù)峰面積定量。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

移取一定量的TMP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/mL和50 μg/mL的TMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，以TMP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸分析。相關(guān)系數(shù)R2大于0.999時(shí)進(jìn)行樣品定量分析。

1.3.4 加標(biāo)樣品回收率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g不含TMP的白醋樣品18 份，1～6號(hào)樣品加入100 μg的TMP，7～12號(hào)樣品加入200 μg的TMP，13～18號(hào)樣品加入1 000 μg的TMP，按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行樣品的預(yù)處理，再按照1.3.2節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

如圖1所示，隨著混合溶劑中甲醇含量的減小和酸性溶液的增加，溶液pH值降低，TMP的最大吸收波長(zhǎng)由282.32 nm和294.17 nm紅移至301.39 nm，而在乙腈和酸性溶液混合溶劑中，TMP在波長(zhǎng)300 nm左右有一個(gè)最大吸收峰。Li Junbo等[30]報(bào)道在pH 1.5的HCl介質(zhì)中，TMP與12-鎢磷酸形成物質(zhì)的量比為3∶1的離子締合物，導(dǎo)致雙波長(zhǎng)共振瑞利散射、二級(jí)散射和倍頻散射光譜顯著增強(qiáng)，并形成新的散射光譜。因此，推斷在不同pH值的酸性溶液中，TMP與酸性物質(zhì)的作用不同導(dǎo)致分子光譜的差異。結(jié)合參考文獻(xiàn)比較TMP在波長(zhǎng)300、297[23]、295 nm[28]和278 nm[29]等幾個(gè)不同波長(zhǎng)的色譜響應(yīng)，選擇采用297 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 不同溶劑中TMP的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig. 1 Ultraviolet-visible spectra of tetramethylpyrazine in different solvents

2.2 流動(dòng)相和色譜柱的選擇

考察不同流動(dòng)相、pH值和流動(dòng)相配比對(duì)TMP色譜行為的影響，同時(shí)對(duì)在UPLC法和在HPLC法中使用的色譜柱進(jìn)行選擇。比較甲醇和水流動(dòng)相、乙腈和水流動(dòng)相、甲醇和乙酸溶液流動(dòng)相、乙腈和乙酸溶液流動(dòng)相以及甲醇＋乙酸和三氟乙酸溶液對(duì)實(shí)際樣品的分離效果，選擇甲醇＋乙酸和三氟乙酸溶液作為流動(dòng)相，通過(guò)優(yōu)化兩相配比和調(diào)節(jié)pH值，確定以25%甲醇和75%酸性溶液（pH 2.4，含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）作為流動(dòng)相。

比較UPLC法中，TMP在Accucore Vanquish C18＋色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分析柱上的色譜行為，考察2 種分離柱對(duì)實(shí)際樣品的分離效果，選擇Accucore Vanquish C18＋色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）作為UPLC法測(cè)定TMP的分離柱。

比較HPLC法中，TMP在ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜行為，考察2 種分離柱對(duì)實(shí)際樣品的分離效果，選擇ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為HPLC法測(cè)定TMP的分離柱。

2.3 提取方法的選擇

鎮(zhèn)江香醋中除了較高含量的乙酸外，還含有丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸以及沒(méi)食子酸、阿魏酸、咖啡?？鼘幩帷⒃瓋翰杷岷拖悴菟岬确铀犷惢衔颷31-32]。TMP是一個(gè)含有1,4-二氮雜苯母環(huán)的化合物，分子結(jié)構(gòu)中有2 個(gè)電負(fù)性較大的N元素。推斷在酸性條件下，TMP在香醋樣品中可以和這些酸性或酚酸化合物通過(guò)超分子作用力如氫鍵形成不規(guī)則的聚集物或者締合物。因此，在提取香醋中TMP時(shí)使其游離出來(lái)，再以酸性溶劑提取會(huì)提高提取效率。實(shí)驗(yàn)考察不同pH值條件下的提取效率，考察色譜峰峰面積與取樣量的比值，結(jié)果表明提取效果在樣品的pH 8.5～8.8時(shí)較好，考察酸性提取液（5%乙酸＋15%水＋80%乙醇）和提取液（20%水＋80%乙醇）對(duì)TMP的提取效果，最終選擇在樣品pH值為8.5條件下，以體積比為5∶15∶80的乙酸-水-乙醇作為提取液。

考察超聲提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，平行稱取同一樣品3 份，按照上述方法處理后再分別超聲處理20、30 min和40 min，計(jì)算峰面積與取樣量的比值，結(jié)果表明超聲提取時(shí)間為30 min和40 min的提取效果無(wú)顯著差異，而超聲提取時(shí)間為20 min的提取效果稍差。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲處理時(shí)間為30 min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和精密度結(jié)果

圖2 TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig. 2 UPLC and HPLC chromatograms of TMP standard solution

分別將不同質(zhì)量濃度的TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液按UPLC和HPLC色譜條件進(jìn)行測(cè)定，如圖2所示。UPLC法分離TMP的保留時(shí)間為1.6 min左右，HPLC法分離TMP的保留時(shí)間為9.7 min左右。由表1可知，TMP質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的相關(guān)性。以10 μg/mL的TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣8 次進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，TMP測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），分別為0.018%（UPLC法）和0.035%（HPLC法），均小于3%，表明精密度滿足方法學(xué)定量的要求。

表1 TMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍Table 1 Linear ranges of standard curves of UPLC and HPLC for TMP

2.5 方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選擇不含TMP的白醋樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。在上述優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，分別對(duì)100、200 μg和1 000 μg添加水平的樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2、圖3所示。平均回收率在87.9%以上。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery tests

圖3 白醋樣品和加標(biāo)樣品色譜圖Fig. 3 UPLC and HPLC chromatograms of unspiked and spiked samples

2.6 方法的檢出限和定量限結(jié)果

根據(jù)GB/T 27417—2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》對(duì)檢出限和定量限的規(guī)定，以3 倍的信噪比確定方法的檢出限，以10 倍的信噪比確定方法的定量限。UPLC法測(cè)定TMP的檢出限為0.000 3 g/kg，定量限為0.001 g/kg，HPLC法測(cè)定TMP的檢出限為0.008 g/kg，定量限為0.025 g/kg。結(jié)果證明，相比HPLC法，UPLC法具有更高的檢測(cè)靈敏度。

2.7 樣品中TMP的含量測(cè)定結(jié)果

鎮(zhèn)江香醋、鎮(zhèn)江陳醋和醋粉中TPM含量分別為0.147、0.294 g/kg和0.250 g/kg，而白醋中不含TMP，結(jié)果如表3、圖4所示。

表3 樣品中TMP含量Table 3 TMP contents in real samples

圖4 鎮(zhèn)江香醋樣品的色譜圖Fig. 4 UPLC and HPLC chromatograms of Zhenjiang vinegar sample

3 結(jié) 論

建立適用于食醋中TMP的分析方法對(duì)于食醋及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和市場(chǎng)監(jiān)管是極其重要的。本研究建立測(cè)定鎮(zhèn)江香醋及其相關(guān)產(chǎn)品中TMP含量測(cè)定的UPLC法和HPLC法。采用酸性乙醇溶液提取TMP，采用C18色譜柱分離，柱溫40 ℃，以25%甲醇和75%酸性溶液（pH 2.4，含1%乙酸和0.05%三氟乙酸）作為流動(dòng)相，在UPLC法中流動(dòng)相流速0.3 mL/min，在HPLC法中流動(dòng)相流速0.8 mL/min，紫外檢測(cè)器297 nm進(jìn)行檢測(cè)，2 種方法重復(fù)測(cè)定結(jié)果的RSD均小于3%，回收率在87.9%以上，UPLC法TMP的檢出限為0.000 3 g/kg，定量限為0.001 g/kg，HPLC法TMP的檢出限為0.008 g/kg，定量限為0.025 g/kg。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，2 種分析方法準(zhǔn)確性好，均適用于食醋及其相關(guān)制品中TMP的含量測(cè)定。UPLC法的靈敏度高，分析速度快，HPLC法適用范圍更廣泛，可以作為有效控制食醋及相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的依據(jù)，具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。