萬 峰，孫思睿，侯雨佳，趙 桉，張 晟，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

雙歧桿菌是人體腸道菌群的重要組成部分，其數(shù)量與人體健康狀況密切相關(guān)。目前，大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明雙歧桿菌具有多種促進(jìn)健康和預(yù)防疾病的益生及保健作用，如維持腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、控制內(nèi)毒素產(chǎn)生、降低血清膽固醇、延緩機(jī)體衰老及促進(jìn)維生素代謝等作用[1-2]，被廣泛應(yīng)用于乳制品和微生態(tài)制劑生產(chǎn)中。含雙歧桿菌的功能性食品已成為當(dāng)前許多國家優(yōu)先研究和發(fā)展的領(lǐng)域，旨在調(diào)整微生態(tài)平衡，預(yù)防腸道疾病，促進(jìn)人體健康。

雙歧桿菌發(fā)揮益生作用的前提是以一定數(shù)量的活菌定植于腸道內(nèi)[3]。被攝食后，雙歧桿菌會(huì)面臨胃酸、膽汁酸及各種蛋白酶的脅迫。因此，能夠耐受腸道內(nèi)環(huán)境并在腸道定植的優(yōu)良雙歧桿菌對(duì)于應(yīng)用具有重要現(xiàn)實(shí)意義。在眾多益生作用中，免疫調(diào)節(jié)功能及機(jī)理一直備受關(guān)注，作為天然存在于結(jié)腸的優(yōu)勢(shì)菌群，雙歧桿菌的種類和數(shù)量變化直接或間接影響機(jī)體的免疫功能。雙歧桿菌一般通過黏附作用定植于腸道內(nèi)，與宿主細(xì)胞相互交流作用，進(jìn)而影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和免疫功能狀態(tài)。因此，有學(xué)者認(rèn)為雙歧桿菌的黏附能力是決定免疫調(diào)節(jié)活性的重要因素之一，可作為前期篩選或評(píng)價(jià)免疫性能的重要指標(biāo)[4]；在體外研究中，常通過對(duì)免疫細(xì)胞的影響探討其免疫調(diào)節(jié)活性。

本研究以從3～6 個(gè)月健康嬰兒糞便自行分離鑒定的4 株動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種作為實(shí)驗(yàn)菌株，比較其耐受性及黏附性能，并進(jìn)一步分析具有優(yōu)良抗性和黏附性能的雙歧桿菌的免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)活性。本實(shí)驗(yàn)旨在獲得具有優(yōu)良性能及潛在益生特性的雙歧桿菌，為后續(xù)研究菌株的功能性成分及開發(fā)益生菌制品提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細(xì)胞株

4 株動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種H15-2、H20-9、H27-9、H34-21，動(dòng)物雙歧桿菌BB12作為參考菌株。均保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

Caco-2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

改良MRS（mMRS）培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，K2PO42 g/L，MgSO4·H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。

細(xì)胞培養(yǎng)基：在完全培養(yǎng)基DMEM中添加10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液。0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

牛膽鹽、α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司；胎牛血清 加拿大Wisent公司；抗生素、Cell Counting kit-8（CCK-8）試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；Trypsin-EDTA 美國Gibco公司；與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的產(chǎn)品均購自美國Corning公司；刀豆蛋白ConA、中性紅 上海Biosharp公司；其他試劑均為國產(chǎn)生化分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用小鼠

小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為6～8 周齡的雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量約為19～21 g，清潔級(jí)。飼養(yǎng)室溫度為（23±2）℃，每天人工燈光照明12 h，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 儀器與設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱 美國Thermo Electron公司；HF90型二氧化碳培養(yǎng)箱 中國香港力康發(fā)展有限公司；UV-2401PC型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；BA300型倒置顯微鏡 廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；冷凍高速離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；GI54DWS型滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；Model 680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

取-20 ℃保藏的雙歧桿菌置于室溫融化，以融化液的3%接種于mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18～20 h。經(jīng)連續(xù)2～3 代液體培養(yǎng)，保證菌株的活力，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 耐受性實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 對(duì)酸和膽鹽的耐受性

參考文獻(xiàn)[5]所述方法略作修改。將離心洗滌后的菌體分別重懸在pH 2、pH 3的磷酸鹽緩沖液及質(zhì)量濃度為3 g/L膽鹽溶液中。酸耐受實(shí)驗(yàn)在孵育0、1、3 h取樣，膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)在0、3 h取樣。存活率表示為孵育不同時(shí)間活菌數(shù)對(duì)數(shù)值與0 h時(shí)活菌數(shù)對(duì)數(shù)值的百分比。

1.3.2.2 對(duì)模擬消化道環(huán)境的耐受性

采用本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)配制的消化液，體外模擬菌體經(jīng)歷消化道的過程[6]。按1.3.2.1節(jié)方法計(jì)算存活率。

1.3.3 黏附性實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞活化培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7]所述方法，通過計(jì)算每孔中黏附菌數(shù)與初始菌數(shù)的比值評(píng)價(jià)黏附能力的大小。

1.3.3.2 菌株對(duì)病原菌黏附Caco-2細(xì)胞的影響

分別采用競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)、排斥實(shí)驗(yàn)、替代實(shí)驗(yàn)研究菌株對(duì)致病菌（大腸桿菌ATCC 25922及鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028）黏附Caco-2細(xì)胞的抑制作用。具體方法參照文獻(xiàn)[8]，通過計(jì)算每孔中未黏附到細(xì)胞的致病菌數(shù)與初始致病菌數(shù)的比值評(píng)價(jià)抑制黏附能力的大小。

1.3.4 菌株產(chǎn)胞外多糖含量的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法參考文獻(xiàn)[9]。取2 mL各溶液于具塞試管中，加6%苯酚溶液1 mL搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：y=0.013 7x-0.005（R2=0.996 4）。y表示吸光度，x表示葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.3.4.2 多糖含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]略作修改。將活化后的菌體接種至10 mL液體mMRS培養(yǎng)基中，100 ℃加熱滅酶15 min，加入1.7 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的三氯乙酸溶液，12 000×g離心20 min收集上清液，加入2 倍體積95%冷乙醇溶液，4 ℃過夜離心取沉淀，蒸餾水溶解沉淀物，4 ℃透析48 h，苯酚-硫酸法測(cè)定胞外多糖含量。

1.3.5 菌株對(duì)免疫細(xì)胞活性的影響

1.3.5.1 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

脾淋巴細(xì)胞制備參照文獻(xiàn)[11]所述，最終調(diào)整細(xì)胞的濃度為2×106個(gè)/mL。在96 孔板中加入180 μL/孔的脾淋巴細(xì)胞懸液，每孔再加入20 μL 106、107、108CFU/mL的雙歧桿菌（即菌數(shù)-細(xì)胞數(shù)分別為1∶1、10∶1、100∶1）作為實(shí)驗(yàn)組；空白對(duì)照組為200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組為180 μL脾淋巴細(xì)胞懸液加入20 μL細(xì)胞培養(yǎng)液；陽性對(duì)照組為180 μL的脾淋巴細(xì)胞懸液加入5 μg/mL ConA；雙歧桿菌對(duì)照組為180 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液加入20 μL上述不同濃度的菌懸液。CCK-8法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖活性[12]。脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值和增殖指數(shù)見式（1）、（2）：

式中：OD1、OD2、OD3、OD4分別為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、雙歧桿菌對(duì)照組、陽性對(duì)照組在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.3.5.2 腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平的測(cè)定

巨噬細(xì)胞制備參照文獻(xiàn)[13]所述。在96 孔板中加入100 μL/孔的巨噬細(xì)胞懸液，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h使其完全貼壁后，用磷酸鹽緩沖液洗去未貼壁細(xì)胞。參照1.3.5.1節(jié)加樣及測(cè)定，以O(shè)D值表示腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平。

1.3.5.3 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的測(cè)定

參照1.3.5.2節(jié)得到巨噬細(xì)胞后，按1.3.5.1節(jié)向每孔中加入100 μL不同濃度的菌懸液，陰性對(duì)照加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去上清液并在每孔加入100 μL中性紅溶液，按照文獻(xiàn)[14]所述方法測(cè)定其吞噬能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 4 株動(dòng)物雙歧桿菌的耐受性

2.1.1 耐酸及膽鹽的能力

在不同pH值條件下，4 株動(dòng)物雙歧桿菌存活率均差異顯著（P＜0.05）（表1），隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)逐漸下降。在pH 3條件下孵育3 h，除H27-9外，其余菌株存活率均在60%以上，其中H15-2（90.19%）的存活率顯著高于其他3 株菌（P＜0.05）。當(dāng)在酸性更強(qiáng)的pH 2環(huán)境中孵育1 h后，4 株菌的存活率均大于60%，而孵育3 h后，除對(duì)照株BB12（57.31%）外，實(shí)驗(yàn)菌株均檢測(cè)不到活菌。在質(zhì)量濃度為3 g/L膽鹽溶液中孵育3 h后，菌株存活率均大于60%，菌株H15-2（94.84%）存活率顯著高于其他受試菌株及對(duì)照株（P＜0.05）。

表1 動(dòng)物雙歧桿菌在酸性及膽鹽條件下的存活率Table 1 Survival rates of B. animalis under acid and bile salt stress%

2.1.2 耐受模擬消化道環(huán)境的能力

為更好地模擬消化道環(huán)境，制備模擬口腔、胃液、腸液的消化液，如圖1所示，菌體在經(jīng)歷模擬唾液5 min、模擬胃液2 h、模擬腸液2 h的過程中，活菌數(shù)不斷下降，最終存活率仍保持在90%以上，表現(xiàn)出對(duì)模擬消化道環(huán)境較好的耐受性，但均顯著低于對(duì)照菌株BB12（P＜0.05）。受試的4 株菌中，H15-2（93.69%）的耐受性顯著高于其他3 株菌（P＜0.05）。3 種模擬消化液中，模擬唾液對(duì)菌體存活影響較小，后兩種消化液的影響更為顯著。

圖1 4 株動(dòng)物雙歧桿菌經(jīng)模擬消化道環(huán)境后的存活率Fig. 1 Survival rates of four B. animalis after being exposed to simulated digestive tract environment

2.2 4 株動(dòng)物雙歧桿菌的黏附力

2.2.1 對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

雙歧桿菌的黏附能力是衡量其能否定植于腸上皮細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮益生作用的重要指標(biāo)。圖2表明，4 株雙歧桿菌中，僅H34-21的黏附率（1.31%）顯著低于其他3 株菌（P＜0.05），其余3 株菌的黏附率均大于或接近20%，與BB12（21.65%）無顯著性差異（P＞0.05），表現(xiàn)出較好的黏附能力，其中H15-2的黏附率高達(dá)27.59%。

圖2 4 株動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力Fig. 2 Adhesion capacities of four B. animalis to Caco-2 epithelial cells

2.2.2 對(duì)致病菌黏附Caco-2細(xì)胞的影響

4 株受試菌對(duì)兩株致病菌黏附Caco-2均有不同程度的抑制作用（表2），除H27-9及H34-21外，其他菌株對(duì)沙門氏菌的黏附抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌。在3 種作用方式中，排斥作用＞競(jìng)爭(zhēng)作用＞替代作用。菌株BB12對(duì)兩種致病菌的黏附抑制率顯著高于4 株受試菌（P＜0.05）。在競(jìng)爭(zhēng)和排斥實(shí)驗(yàn)中，H20-9、H27-9對(duì)兩種致病菌顯示出了明顯的抑制效果；在替代實(shí)驗(yàn)中，H27-9、H15-2對(duì)沙門氏菌有較好的抑制作用。

表2 4 株動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)致病菌黏附Caco-2細(xì)胞的抑制率Table 2 Inhibition rates of four B. animalis against adhesion of pathogenic bacteria to Caco-2 cells

2.3 4 株動(dòng)物雙歧桿菌產(chǎn)胞外多糖能力

圖3 動(dòng)物雙歧桿菌胞外多糖的產(chǎn)量Fig. 3 EPS production of B. animalis

所有菌株均能合成胞外多糖且多糖產(chǎn)量均超過100 mg/L（圖3）。4 株受試菌產(chǎn)胞外多糖能力均顯著高于對(duì)照菌株BB12（P＜0.05），表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)胞外多糖能力，其中H15-2胞外多糖產(chǎn)量最高，達(dá)到121.87 mg/L。

2.4 動(dòng)物雙歧桿菌H15-2對(duì)免疫細(xì)胞活性的影響

2.4.1 對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)黏附及脅迫抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇動(dòng)物雙歧桿菌H15-2進(jìn)行體外免疫活性實(shí)驗(yàn)，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值可以直接反映淋巴細(xì)胞的活性大小，是衡量T淋巴細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值隨受試菌濃度增大而增加，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系（圖4A）。當(dāng)菌數(shù)-細(xì)胞數(shù)比例為10∶1及100∶1時(shí)，菌株H15-2對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化值顯著高于陽性對(duì)照組ConA（P＜0.05），表明H15-2可以調(diào)節(jié)脾淋巴細(xì)胞活性且在菌數(shù)大于107CFU/mL時(shí)效果更好。

淋巴增殖指數(shù)可以衡量菌體對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響，即增殖指數(shù)大于1時(shí)表示促進(jìn)增殖，增殖指數(shù)小于1時(shí)表示抑制增殖[16]。發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)H15-2菌體濃度為108CFU/mL時(shí)，脾淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)大于1且顯著高于陽性對(duì)照（P＜0.05）（圖4B），表明H15-2具有促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的作用。

圖4 動(dòng)物雙歧桿菌H15-2對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化值（A）和淋巴增殖指數(shù)（B）的影響Fig. 4 Effects of B. animalis H15-2 on transformation of splenic lymphocytes (A) and proliferation index (B)

2.4.2 對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平的影響

腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平與H15-2菌體濃度表現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（圖5），當(dāng)菌體與巨噬細(xì)胞的比例為10∶1及100∶1時(shí)，巨噬細(xì)胞能量代謝水平顯著高于陽性對(duì)照組ConA（P＜0.05）。表明動(dòng)物雙歧桿菌H15-2可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活性并促進(jìn)其增殖，提高其能量代謝水平。

圖5 動(dòng)物雙歧桿菌H15-2對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞代謝能量水平的影響Fig. 5 Effect of B. animalis H15-2 on energy metabolism level in macrophages

2.4.3 對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響

通過巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的方法評(píng)價(jià)雙歧桿菌H15-2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響，OD570nm值越高表示巨噬細(xì)胞的吞噬能力越強(qiáng)。當(dāng)H15-2菌數(shù)-細(xì)胞數(shù)比例為10∶1及100∶1時(shí)，可以明顯提高巨噬細(xì)胞的吞噬作用（P＜0.05）（圖6），表明H15-2能夠提高巨噬細(xì)胞活性，增強(qiáng)其吞噬功能，且吞噬能力與菌體數(shù)量呈劑量依賴關(guān)系。

圖6 動(dòng)物雙歧桿菌H15-2對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Fig. 6 Effect of B. animalis H15-2 on phagocytic activity of peritoneal macrophages

3 討論與結(jié)論

國際糧農(nóng)及世界衛(wèi)生組織[17]建議，益生菌在應(yīng)用前必須經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)以確保其到達(dá)腸道之后具有較高的存活率和定植能力進(jìn)而發(fā)揮益生功能。在其建議的體外實(shí)驗(yàn)中，特別強(qiáng)調(diào)對(duì)人工模擬消化道脅迫環(huán)境（胃酸和膽汁鹽）的耐受力以及對(duì)腸黏膜的黏附能力。因?yàn)轲じ绞且嫔l(fā)揮益生作用的先決條件，抵御消化道脅迫環(huán)境能力是其存活的保證。

雙歧桿菌被人體攝入后面臨高胃酸和高膽鹽環(huán)境。一般來說，胃液的pH值在3左右，但受飲食影響會(huì)有較大波動(dòng)，極少情況下會(huì)達(dá)到2以下，小腸中膽鹽占0.03%～0.3%左右，食物通過胃的時(shí)間為1～2 h，通過小腸的時(shí)間則較短[18]。由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和困難性，國內(nèi)外研究大多集中于酸脅迫、膽鹽脅迫等單一因素評(píng)價(jià)菌株對(duì)消化道環(huán)境的抗性進(jìn)而篩選出耐受力較強(qiáng)的菌株。Matsumoto等[19]分析了9 種雙歧桿菌的耐酸性，研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌、青春雙歧桿菌耐酸性較差，在pH 3條件下處理1 h活菌數(shù)顯著降低，pH 2條件下處理1 h無活菌檢出。與此結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)的4 株動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)酸有更好的耐受能力，經(jīng)pH 3和pH 2條件下孵育1 h后，仍有超過80%和60%的存活率，這可能是由于不同菌種間的差異造成的，Margolles等[20]報(bào)道動(dòng)物雙歧桿菌較其他雙歧桿菌具有更強(qiáng)的耐酸能力。相似地，Charnchai等[21]從嬰兒糞便分離出的4 株動(dòng)物雙歧桿菌在3 g/L質(zhì)量濃度膽鹽中孵育4 h后，菌株存活率在84%～90%之間。而本研究的菌株在相同膽鹽質(zhì)量濃度下處理3 h后存活率均大于60%，其中H15-2的存活率高達(dá)94.84%。此外，研究表明雙歧桿菌的耐酸機(jī)制主要與F0F1-ATPase酶活性有關(guān)，而具有膽鹽耐受力的菌株與其膽鹽水解酶、表層蛋白、細(xì)胞膜脂肪酸的構(gòu)成、胞外多糖等有關(guān)[20]。由此可見，本實(shí)驗(yàn)的4 株動(dòng)物雙歧桿菌均具備較好的耐酸、耐膽鹽能力。

本實(shí)驗(yàn)除考慮菌株對(duì)酸及膽鹽的耐受性外，還通過體外連續(xù)模擬消化道環(huán)境評(píng)價(jià)其耐受性。由于消化道是一個(gè)完整體系并且其中存在各種消化酶，因而較單純的酸性及膽鹽環(huán)境，連續(xù)模擬消化道環(huán)境更能反映菌體通過腸道的真實(shí)情況。李軍等[22]通過連續(xù)模擬胃液、十二指腸液、小腸液觀察動(dòng)物雙歧桿菌RH對(duì)整個(gè)消化道逆環(huán)境的耐受性，存活率依次為90%、76%、73%；Madureira等[23]采用體外連續(xù)4 步模擬消化道（口腔、胃、十二指腸、回腸）評(píng)價(jià)菌株的耐受能力，動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)對(duì)數(shù)值僅下降1 個(gè)數(shù)量級(jí)。本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)的連續(xù)模擬消化道環(huán)境與這些實(shí)驗(yàn)類似，但本實(shí)驗(yàn)的4 株動(dòng)物雙歧桿菌在歷經(jīng)模擬消化道后仍有90%的存活率，且活菌數(shù)對(duì)數(shù)值下降不到1 個(gè)數(shù)量級(jí)，H15-2存活率高達(dá)96.7%，這表明本實(shí)驗(yàn)4 株動(dòng)物雙歧桿菌具有較強(qiáng)的抗消化道脅迫能力。較單純的酸性環(huán)境，菌株在模擬消化道環(huán)境中的存活率更高，這可能是由于蛋白酶的存在降低了酸性環(huán)境的極化程度，從而在一定程度上保護(hù)了菌體細(xì)胞[24]。而胃液較腸液對(duì)菌株的影響更為顯著主要是因?yàn)閜H值對(duì)菌體存活影響更為顯著。由于條件限制，本方法未能模擬胃腸蠕動(dòng)及pH值的動(dòng)態(tài)變化，有一定缺陷和不足，但仍可作為前期篩選耐受性優(yōu)良菌株的重要依據(jù)。

雙歧桿菌經(jīng)口攝入人體后，除能夠經(jīng)歷消化道脅迫環(huán)境以較高活菌濃度進(jìn)入腸道，還要具備較好的黏附定植能力，才能發(fā)揮其最大的生理活性。黏附是細(xì)菌與宿主細(xì)胞相互作用的第1步，也是細(xì)菌定植的必要條件。早期研究表明，使用Caco-2細(xì)胞體外評(píng)價(jià)雙歧桿菌黏附能力的結(jié)果與體內(nèi)黏附腸上皮細(xì)胞水平有一定的相關(guān)性[25]。Xu等[26]測(cè)定了8 種益生菌的表面性質(zhì)及對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能，黏附率最高的為鼠李糖乳桿菌LGG（23.2%），其次是長(zhǎng)雙歧桿菌（20%）；Arboleya等[27]采用熒光標(biāo)記法分析了來源于母乳中的雙歧桿菌對(duì)人腸黏膜的黏附能力，其中長(zhǎng)雙歧桿菌的黏附率高達(dá)50%。與Xu等[26]所應(yīng)用的菌株比較，本實(shí)驗(yàn)的雙歧桿菌H15-2的黏附率高于商業(yè)菌株LGG和BB12，可達(dá)27%，具有較強(qiáng)的黏附性能。而相較Arboleya等[27]的實(shí)驗(yàn)，H15-2的黏附能力略差，這主要是由于Arboleya等[27]采用熒光標(biāo)記法評(píng)價(jià)黏附能力，該方法可以反映死菌對(duì)細(xì)胞的黏附情況；而本實(shí)驗(yàn)則采用了平板菌落計(jì)數(shù)法，評(píng)價(jià)的是存活菌體的黏附。由此可見，黏附模型不同，菌株生境來源以及種屬不同，雙歧桿菌的黏附能力存在較大差異[28]。目前，關(guān)于雙歧桿菌的黏附機(jī)理尚未完全清楚，大部分學(xué)者認(rèn)為，雙歧桿菌發(fā)揮其黏附功能大多與其表面的脂磷壁酸、多糖和表層蛋白等有關(guān)[29]。

此外，雙歧桿菌黏附能力與對(duì)病原微生物的黏附抑制作用密切相關(guān)，這是由于具有較好黏附能力的菌株可以通過競(jìng)爭(zhēng)黏附受體、爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、增強(qiáng)免疫應(yīng)答等方式抑制腸道致病菌的黏附[30]。本研究中的4 株動(dòng)物雙歧桿菌可以通過競(jìng)爭(zhēng)、排除和替換方式抑制致病菌的黏附，從而起到保護(hù)宿主細(xì)胞的作用，菌株H20-9和H27-9對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌黏附抑制率最高可分別達(dá)75.04%和66.5%。Candela等[31]采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法研究了4 種益生菌對(duì)腸道致病菌沙門氏菌和大腸桿菌黏附Caco-2細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示所有菌株對(duì)沙門氏菌的黏附抑制率均高于大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)中2 株菌（H15-2和H20-9）與其結(jié)果類似，另2 株菌則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。Candela等[31]實(shí)驗(yàn)的1 株動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)沙門氏菌及大腸桿菌黏附抑制率分別達(dá)88%和44%，本實(shí)驗(yàn)4 株動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)兩者的抑制率分別在10%～75%和8%～67%之間，相比較，本實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物雙歧桿菌對(duì)沙門氏菌抑制效果略差，但部分菌株（H27-9、H20-9）對(duì)大腸桿菌的抑制效果較好。這種差異一方面源于菌株的不同，另一方面是由于評(píng)價(jià)方法不同，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法反映死、活菌體對(duì)細(xì)胞的黏附，而平板計(jì)數(shù)法只能反映活菌體的黏附。

作為益生菌分泌的一種生理活性物質(zhì)，胞外多糖被認(rèn)為與菌體對(duì)消化道環(huán)境耐受性、腸黏膜黏附力及免疫調(diào)節(jié)活性等具有相關(guān)性。Hidalgocantabrana等[32]報(bào)道高產(chǎn)胞外多糖的雙歧桿菌能增加其在胃腸道的抗性，Ruasmadiedo等[33]實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明胞外多糖的存在可以增加益生菌對(duì)腸黏膜的黏附性。本實(shí)驗(yàn)中，胞外多糖最高的H15-2同樣具有最強(qiáng)的耐受性和黏附能力，推測(cè)三者可能具有一定的關(guān)聯(lián)性，但耐受性較強(qiáng)的BB12胞外多糖產(chǎn)量卻最低。因此，本研究胞外多糖合成相關(guān)結(jié)果與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性并不明顯，且具體對(duì)耐受性及黏附性的貢獻(xiàn)度尚未得知，需要更加深入研究其機(jī)制以證實(shí)三者間的聯(lián)系。此外，有研究指出與消化道逆環(huán)境耐受能力高度相關(guān)的多糖為莢膜多糖[34]，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得粗多糖為黏液多糖，因此仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究其相關(guān)性。雙歧桿菌合成胞外多糖的量通常較低，一般平均在每升幾十到幾百毫克不等[35]。本實(shí)驗(yàn)的4 株動(dòng)物雙歧桿菌胞外多糖平均產(chǎn)量在120 mg/L左右，顯著高于對(duì)照株BB12。雙歧桿菌的胞外多糖還具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇等作用[36]，可作為前期篩選具有益生特性菌株的重要指標(biāo)之一。

體外評(píng)價(jià)雙歧桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用，大多采用機(jī)體主要的免疫細(xì)胞，如脾淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等反映益生菌對(duì)免疫功能的影響。淋巴細(xì)胞可以反映細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱，而巨噬細(xì)胞則在非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[37]。李艾黎等[16]發(fā)現(xiàn)無論是活性乳桿菌還是熱致死乳桿菌對(duì)于小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖均有一定的促進(jìn)作用，這種作用表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，將雙歧桿菌的劑量提高10 倍（即細(xì)菌數(shù)-細(xì)胞數(shù)比例為100∶1），發(fā)現(xiàn)具有良好耐受性及黏附性的雙歧桿菌H15-2對(duì)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖都有明顯促進(jìn)作用，在一定程度上可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，對(duì)兩種免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)效果呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。而范志紅等[38]研究則表明高濃度的菌體（＞109CFU/mL）對(duì)巨噬細(xì)胞活性有抑制作用，但具體原因尚不清楚，且益生菌到達(dá)腸道前活菌數(shù)仍會(huì)有損失，因此本實(shí)驗(yàn)僅限于體外研究，在體內(nèi)具體的有效劑量仍需進(jìn)一步探索研究。目前，對(duì)于雙歧桿菌免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理的研究還不透徹，但普遍認(rèn)為雙歧桿菌菌體表面成分，如肽聚糖、脂磷壁酸、表層蛋白等，或分泌至菌體外的可溶性物質(zhì)，如抗菌物質(zhì)、胞外多糖及分泌蛋白等，能通過M細(xì)胞進(jìn)入集合淋巴結(jié)，激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[39]。

綜上所述，動(dòng)物雙歧桿菌H15-2具有良好的耐受性、黏附力及產(chǎn)胞外多糖能力，并且具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，可作為具有益生功能的菌株進(jìn)行深入研究和開發(fā)。