裴興武，汪 鴻，高子雯，袁泰增，高 明，姚 凱，潘明喆,*，于殿宇,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.湖北天星糧油股份有限公司，湖北 隨州 441300）

米糠是稻谷碾米加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，約占整個(gè)糙米產(chǎn)量的8%～10%，我國(guó)年產(chǎn)米糠1 000萬(wàn) t以上[1]。國(guó)內(nèi)外研究表明米糠是最具開(kāi)發(fā)潛力的一種高附加值的資源，它不僅有高含量的脂肪和蛋白質(zhì)，而且還含有抗微生物、抗癌和其他能促進(jìn)健康的功能物質(zhì)[2]，如膳食纖維、維生素谷維素、礦物質(zhì)、植酸、蛋白酶抑制劑、α-淀粉酶抑制劑、丹寧等。米糠中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%～15%[3]，其中賴氨酸含量比米胚乳中高，也比其他谷物米糠蛋白中的含量高。米糠蛋白的效價(jià)比為2.0～2.5（酪蛋白為2.5）[4]，蛋白消化率達(dá)90%，且米糠蛋白是低過(guò)敏性蛋白，是唯一可以免于過(guò)敏實(shí)驗(yàn)的谷物蛋白。因而，米糠蛋白被認(rèn)為是一種理想的嬰兒食品原料，并將其添加到對(duì)一些食物過(guò)敏的兒童膳食中[5-7]。雖然米糠的營(yíng)養(yǎng)和藥理特性已被廣泛認(rèn)可，但目前米糠濃縮蛋白和分離蛋白并沒(méi)有商品化，主要原因是米糠蛋白溶解性差[7-8]。因而，如何提高米糠蛋白的溶出得率和改善其功能特性，成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，我國(guó)提取米糠蛋白的工作已在不少地區(qū)得到大規(guī)模開(kāi)展。在米糠蛋白的生產(chǎn)中，會(huì)排放出大量米糠廢水，采用傳統(tǒng)的廢水處理工藝對(duì)米糠廢水的處理會(huì)使廢水中含有的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被浪費(fèi)。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶，MTG；EC2.3.2.13）是一種能催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)（或多肽）之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)形成共價(jià)化合物的聚合酶[9-11]，所以它可催化蛋白質(zhì)中多肽發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，從而使米糠廢水中蛋白分離出來(lái)[12]。經(jīng)MTG交聯(lián)形成的米糠蛋白聚合物具有良好的水溶性[13]、乳化性以及穩(wěn)定性[14]而廣泛應(yīng)用在食品行業(yè)，它一方面改善食品的物性，另一方面優(yōu)化食品的質(zhì)構(gòu)和感官。Clare等[15]在花生蛋白粉中加入MTG，促使花生蛋白發(fā)生交聯(lián)，使蛋白溶解性得到改善，從而有利于消化吸收。劉穎等[16]利用MTG研究大豆11S球蛋白聚合效果，發(fā)現(xiàn)改善了聚合前的穩(wěn)定性，從37.78%提高到了79.28%。在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，游離酶在高溫、過(guò)酸和過(guò)堿條件下容易變性失活，并且在實(shí)際生產(chǎn)中難以回收。酶的固定化技術(shù)很好的解決了很多問(wèn)題，例如使酶的最適溫度范圍變寬，它也可以將酶從反應(yīng)產(chǎn)物中分離，提高重復(fù)使用性，從而提高反應(yīng)效率[17-19]。

分離膜不僅能夠?qū)怏w、有機(jī)物、各類生物制劑等進(jìn)行有效的分離、濃縮和純化，而且還能作為固定化酶的載體，實(shí)現(xiàn)酶的膜固定化[20-21]。醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜具備良好的疏水性、吸附性以及化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[22]，并且能將酶的催化特性和膜的優(yōu)良分離性能有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，構(gòu)成酶膜生物反應(yīng)器[23]，在工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。Merz等[24]使用蛋白水解酶制劑Flavourzyme?在酶膜反應(yīng)器中進(jìn)行了原始食品級(jí)連續(xù)長(zhǎng)期水解過(guò)程，在反應(yīng)器中酶被重復(fù)使用，與參考批處理相比，酶生產(chǎn)率提高了450%。Baldassarre等[25]利用連續(xù)膜酶生物反應(yīng)器將洋蔥皮酶解成果膠低聚糖，研究其水解性能，取得了良好的水解效果。Hang Hua等[26]研究酶膜反應(yīng)器與納米過(guò)濾膜系統(tǒng)相結(jié)合，研究菊粉轉(zhuǎn)化的高濃度DFA III，結(jié)果表明，EMR與NF膜結(jié)合的體系包含5 L的溶液體積，超濾和納米過(guò)濾膜的分子質(zhì)量截止值為5 kDa和150 Da，DFA III質(zhì)量濃度增加至約400 g/L。該系統(tǒng)可以提供穩(wěn)定的操作并且可以持續(xù)運(yùn)行8 次，可以滿足工業(yè)化生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜，并將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行膜固定化，依據(jù)最佳條件制得固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜，對(duì)固定化酶膜進(jìn)行表征分析。并且通過(guò)將制備好的固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜固定在不銹鋼網(wǎng)框上懸掛于燒杯中用來(lái)聚合米糠廢水中的蛋白質(zhì)。在一定轉(zhuǎn)速條件下，利用響應(yīng)面確定物料溫度、物料pH值、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速、酶膜面積與底物含量的比例和反應(yīng)時(shí)間等最佳條件，并以蛋白聚合率為指標(biāo)，研究固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化米糠廢水中米糠蛋白聚合率的影響，為連續(xù)化保留米糠廢水中的蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠廢水（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0.51%） 湖北天星糧油股份有限公司；微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 上海一鳴生物科技有限責(zé)任公司；N-α-CBZ-Gln-Gly 美國(guó)Sigma公司；醋酸纖維素 北京惠寶聯(lián)化科技有限公司；聚丙烯膜（孔徑0.1 μm） 鄭州華膜水處理器材有限公司；丙酮 河南富達(dá)化工產(chǎn)品有限公司；三氯乙酸、FeCl3·6H2O 威海恒邦化工公司；L-谷氨酸γ-單羥肟酸深圳市迪肯科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-260紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；80-2高速離心機(jī) 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；DF-1磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；SY-2-4恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；ZK-82B真空干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；SHB-III T循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì)瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜的制備

準(zhǔn)確稱取10 g醋酸纖維素充分溶解于200 mL丙酮中，等到一定時(shí)間形成均勻成型的膜液之后，再將聚乙烯緩慢放到膜液當(dāng)中，等到其自然成膜，然后用大量去離子水沖洗數(shù)次干燥備用[27]。

1.3.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的固定化

采用吸附與交聯(lián)相結(jié)合的固定化方法，取一定規(guī)格的醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜于燒杯中，加入質(zhì)量濃度15 mg/mL的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶液和pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中，吸附3 h。再加入質(zhì)量濃度0.3 g/100 mL的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，4 h后將膜取出，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗除去多余的酶液并干燥[28]，并將干燥好的固定化酶膜固定在不銹鋼網(wǎng)框上，浸入磷酸鹽緩沖液中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 掃描電鏡分析

采用掃描電鏡（放大倍數(shù)為5 000）分別對(duì)空白膜和酶固定化后的膜進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)特征檢測(cè)，然后進(jìn)行比較。

1.3.4 固定化酶膜處理米糠廢水單因素試驗(yàn)

將固定好酶膜的網(wǎng)框懸掛在1 000 mL的燒杯中，約在離杯口1/3處，將米糠廢水通入到燒杯中，在磁力攪拌的作用下與酶膜充分接觸2 h。分別選取物料溫度34～50 ℃，物料pH 5.5～7.5，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速95～155 r/min，酶膜面積與底物含量比例76∶1～84∶1（cm2/g），反應(yīng)時(shí)間0.5～2.5 h研究對(duì)酶解效果的影響，測(cè)定不同條件聚合前后的米糠廢水的蛋白質(zhì)含量，以蛋白聚合率為指標(biāo)，每組實(shí)驗(yàn)平均做3 次。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)1.3.4節(jié)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在此基礎(chǔ)上采用Box-Behnken模型，分別對(duì)物料溫度（A）、物料pH值（B）、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速（C）、酶膜面積與底物含量比例（D）和反應(yīng)時(shí)間（E）5 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，并以蛋白聚合率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used in response surface analysis

1.3.6 固定化酶膜重復(fù)使用次數(shù)

在響應(yīng)面最佳條件下進(jìn)行反應(yīng)，在每一次使用結(jié)束后取一部分酶膜進(jìn)行酶活力測(cè)定，考察重復(fù)使用次數(shù)對(duì)酶膜相對(duì)酶活力的影響。

1.3.7 測(cè)定方法

1.3.7.1 載酶量測(cè)定

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶載酶量測(cè)定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法[29]。

采用凱氏定氮法分別測(cè)定固定化前后的醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜的蛋白質(zhì)含量，以及清洗固定化酶膜所用磷酸鹽緩沖溶液中的蛋白含量。根據(jù)公式（1）計(jì)算載酶量：

式中：C0為固定化之前酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；C為固定化之后酶溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Cw為沖洗固定化酶膜之后，所用磷酸鹽緩沖溶液中的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為固定化實(shí)驗(yàn)所用酶溶液體積/mL；Vw為沖洗固定化酶膜之后，所用磷酸鹽緩沖溶液體積/mL；W為浸入酶溶液中的膜面積/cm2。

1.3.7.2 酶活力測(cè)定

采用Folk等[30]的分光異羥肟酸分析法進(jìn)行測(cè)定。一個(gè)酶活力單位表示為：37 ℃時(shí)1 min催化1 μmol N-α-CBZ-Gln-Gly生成單羥肟酸所消耗酶量，單位為U/g。相對(duì)酶活力：每組中所測(cè)酶活力與該組中測(cè)得的最高酶活力二者的相對(duì)百分比表示。

1.3.7.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用GB 5009.5—2016中的凱氏定氮法測(cè)定。

1.3.7.4 蛋白質(zhì)聚合率測(cè)定

廢水處理前蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度記為C1/（mg/mL），廢水處理后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度記為C2/（mg/mL），并利用公式（2）計(jì)算蛋白質(zhì)聚合率：

1.3.7.5 酶膜面積的計(jì)算

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，需添加酶與蛋白比為1.1 U/g，酶膜經(jīng)裁剪為長(zhǎng)方形形狀，并且根據(jù)公式（3）計(jì)算酶膜面積：

式中：S為酶膜面積/cm2；V為廢水樣體積/mL；A為酶膜的酶活/（U/g）；B為酶膜單位面積載酶量/（mg/cm2）。

1.3.7.6 其他成分測(cè)定

化學(xué)需氧量（chemical oxygen demand，COD）測(cè)定：采用Cr法測(cè)定廢水中COD值；生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）測(cè)定：根據(jù)測(cè)定的COD值，采用稀釋接種法測(cè)定廢水中BOD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理用Origin 2017軟件來(lái)整理與分析，用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，響應(yīng)面用Design-Expert 8.0.6軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶膜的酶載量以及酶活力

依據(jù)1.3.7節(jié)中相關(guān)酶載量以及酶活力測(cè)定的方法，測(cè)得單位面積酶載量為0.81 mg/cm2，酶活力為17.6 U/g。固定化酶的活力相較于游離酶的活力有所降低，主要是因?yàn)楣潭ɑ^(guò)程會(huì)損傷一定的酶活。

2.2 酶膜的掃描電鏡

分別對(duì)制得的空白膜及固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜做掃描電鏡，結(jié)果如圖1所示。

圖1 微孔膜和固定化酶膜電鏡掃描圖Fig. 1 Scanning electron microscopy images of microporous membrane and enzyme-immobilized membrane

從圖1a可以看出，空白醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜呈現(xiàn)纖維狀，纖維相互錯(cuò)亂交叉，排列不規(guī)則，但表面很平整光滑、致密、均勻，代表穩(wěn)定性好[28]。從圖1b可看出，此時(shí)酶蛋白固定化后的膜表面由于交聯(lián)了蛋白的基團(tuán)，存在一些顆?；驁F(tuán)狀的物體而顯得有些粗糙，而且這些顆粒大小不一，形狀各異，附著在纖維表面，并且纖維表面大部分被酶覆蓋[31]?？梢哉f(shuō)明MTG已經(jīng)固定在醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜上。

2.3 酶膜處理米糠廢水的單因素試驗(yàn)

將固定有酶膜的網(wǎng)框懸掛在燒杯中，控制米糠廢水的反應(yīng)pH 6.5、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速125 r/min、酶膜面積與底物含量比例80∶1（cm2/g）、反應(yīng)時(shí)間1.5 h。

2.3.1 物料溫度對(duì)蛋白聚合率的影響

圖2 物料溫度對(duì)蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 2 Effect of material temperature on protein polymerization rate

由圖2可知，蛋白聚合率隨溫度變化的趨勢(shì)為先快速增高后趨于平穩(wěn)。當(dāng)物料溫度小于42 ℃時(shí)，蛋白聚合率很明顯地隨物料溫度的升高而升高，說(shuō)明酶膜活性隨溫度的升高不斷增強(qiáng)，與廢水中的蛋白充分聚合，從而分離下來(lái)。但物料溫度升至42 ℃時(shí)蛋白聚合率達(dá)到65%，溫度繼續(xù)升高蛋白聚合率趨勢(shì)穩(wěn)定，并沒(méi)有顯著變化，可能是此時(shí)的蛋白發(fā)生變性[32]，蛋白聚合率變化趨勢(shì)不明顯。因此本實(shí)驗(yàn)把物料溫度確定在42 ℃左右。

2.3.2 物料pH值對(duì)蛋白聚合率的影響

圖3 物料pH值對(duì)蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 3 Effect of material pH on protein polymerization rate

由圖3可知，蛋白聚合率隨pH值的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為5.5～6.5之間時(shí)蛋白聚合率隨pH值的升高而升高，pH值為6.5時(shí)蛋白聚合率最高達(dá)68%，而當(dāng)pH值繼續(xù)升高，蛋白聚合率下降。由此可見(jiàn)，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性條件下會(huì)破壞酶的活性位點(diǎn)，從而使酶失活[33]，不利于酶膜發(fā)揮聚合作用，對(duì)米糠蛋白的聚合效果較差。從而得知酶膜的最佳反應(yīng)pH值在中性條件附近，所以選取pH值在6.5左右。

2.3.3 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白聚合率的影響

圖4 轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速對(duì)蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 4 Effect of rotor speed on protein polymerization rate

由圖4可知，當(dāng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速時(shí)，蛋白聚合率呈現(xiàn)先較上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速在95～125 r/min時(shí)，蛋白聚合率隨轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速的增大而增大，因?yàn)檫m當(dāng)?shù)臄嚢栊Ч梢允箯U水中的蛋白與酶膜充分接觸，從而提高聚合率。當(dāng)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速大于125 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速的增大，蛋白聚合率反而下降，強(qiáng)力的攪拌使得廢水中的蛋還未與酶膜充分接觸聚合，從而造成聚合率降低。所以，將轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速確定在125 r/min附近。

2.3.4 酶膜面積與底物含量比例對(duì)蛋白聚合率的影響

由圖5可知，蛋白質(zhì)聚合率隨其比例的增大呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)比例小于80∶1 （cm2/g）時(shí)，隨著酶膜面積的增大，會(huì)提供更多的聚合位點(diǎn)聚合廢水中的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)聚合率相應(yīng)地提高。當(dāng)比例大于80∶1（cm2/g）時(shí)，此時(shí)廢水中的蛋白質(zhì)含量一定，過(guò)多的酶膜面積起不到聚合蛋白質(zhì)的作用，從而造成酶膜的浪費(fèi)。所以，選擇酶膜面積與底物含量比例在80∶1（cm2/g）左右。

圖5 酶膜面積與底物含量的比例對(duì)蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 5 Effect of ratio between enzyme-loaded membrane area andsubstrate amount on protein polymerization rate

2.3.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白聚合率的影響

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 6 Effect of reaction time on protein polymerization rate

由圖6可知，蛋白質(zhì)聚合率隨反應(yīng)時(shí)間的增大呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在1.5 h之前，因?yàn)榉磻?yīng)未達(dá)到充分，樣品中蛋白并沒(méi)有被全部聚合，所以出現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大的現(xiàn)象。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在1.5 h之后，樣品中蛋白被聚合完全，蛋白聚合率趨于平穩(wěn)，繼續(xù)增大反應(yīng)時(shí)間并不能取得更好的效果，所以，選取反應(yīng)時(shí)間在1.5 h左右。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)設(shè)定A（物料溫度）、B（物料pH）、C（轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速）、D（酶膜面積與底物含量比例）、E（反應(yīng)時(shí)間）分別是影響因素，Y（蛋白聚合率）為響應(yīng)值得到5因素3水平設(shè)計(jì)與結(jié)果，如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design in terms of coded values with results for response surface analysis

續(xù)表2

2.4.2 模型方差與分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)2.4.1節(jié)中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，得到回歸線方程為：

由表3可知，回歸模型中以蛋白聚合率為響應(yīng)值的F值為71.05，P＜0.000 1，表明在利用回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著，說(shuō)明得到的回歸方程可靠[34]。通過(guò)方差分析失擬項(xiàng)大于0.05，表明此差異不顯著，說(shuō)明回歸區(qū)域內(nèi)擬合良好，該模型選擇正確。多元相關(guān)系數(shù)R2=98.27%＞0.8，表明在此模型中各個(gè)因素和響應(yīng)值之間相關(guān)性好[35]，可以通過(guò)此模型分析和預(yù)測(cè)蛋白聚合率。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.4.3 交互參數(shù)的等高線圖

圖7 交互參數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)聚合率的影響Fig. 7 Response surface plots showing the interactive effect of various parameters on protein polymerization rate

交互項(xiàng)的交互曲線越陡，表明越顯著，并且形成的曲面為較為規(guī)則的形態(tài)[36]。由圖7可知，物料溫度、物料pH值、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速、酶膜面積與底物含量的比例以及反應(yīng)時(shí)間5 個(gè)變量在交互時(shí)，控制3 個(gè)變量恒定，隨著其他2 個(gè)變量的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在交互結(jié)果中，AD、BC顯示極顯著，AB、AC、BD顯著，即物料溫度和酶膜面積與底物含量的比例、物料pH值和轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速之間交互極顯著，而物料溫度和物料pH值、物料溫度和轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速、物料pH值和酶膜面積與底物含量的比例之間交互顯著。通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化得到最佳條件為物料溫度42.9 ℃、物料pH 6.60、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速123.7 r/min、酶膜面積與底物含量的比例80.23∶1（cm2/g）、反應(yīng)時(shí)間1.81 h，在此條件下得到蛋白質(zhì)聚合率為70.1%。根據(jù)實(shí)際情況得出整理值，整理值為物料溫度43 ℃、物料pH 6.6、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速124 r/min、酶膜面積與底物含量的比例80∶1（cm2/g）、反應(yīng)時(shí)間1.8 h。在此整理?xiàng)l件下，做3 次平行試驗(yàn)，蛋白質(zhì)聚合率平均值為70%，進(jìn)一步說(shuō)明此回歸模型建立良好，與實(shí)際值相吻合，可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)聚合率。

2.5 酶膜的重復(fù)使用次數(shù)

在2.4節(jié)響應(yīng)面優(yōu)化最佳條件下考察重復(fù)使用次數(shù)對(duì)固定化酶膜的相對(duì)酶活力的影響，如圖8所示。

圖8 酶膜的相對(duì)酶活力隨使用次數(shù)變化Fig. 8 Change in relative enzymatic activity of enzyme-loaded membrane after repeated use

由圖8可知，酶膜的相對(duì)酶活力呈現(xiàn)隨操作次數(shù)的增加而降低的趨勢(shì)，經(jīng)10 次使用后，相對(duì)酶活力為51.5%。這可能是由于隨著操作次數(shù)的增加，酶膜受到一定程度的機(jī)械損傷，致使相對(duì)酶活力降低。部分破損、部分固定化酶脫落等現(xiàn)象的出現(xiàn)，也會(huì)降低固定化酶的活性。酶本身的失活和酶活力低也會(huì)致使固定化酶活力降低。但在圖中可以看出，酶膜在重復(fù)使用5 次后，相對(duì)酶活力仍可保持在74.3%以上。

2.6 主要指標(biāo)對(duì)比

表4 米糠廢水處理前后成分含量對(duì)比Table 4 Comparison of protein content, COD and BOD of rice bran wastewater before and after treatment with MTG-loaded membrane

米糠廢水中主要指標(biāo)在處理前后有一定的變化，成分變化如表4所示。處理后比處理前蛋白質(zhì)、COD值和BOD值各個(gè)指標(biāo)均有相對(duì)顯著幅度的下降，表明此次實(shí)驗(yàn)良好，利用醋酸纖維素-聚丙烯膜固定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)米糠廢水中蛋白的聚合起到了良好的效果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)首先制備了醋酸纖維素-聚丙烯復(fù)合膜，將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶固定在復(fù)合膜上，制得了固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶膜，其單位面積酶載量為0.81 mg/cm2，并對(duì)酶膜進(jìn)行表征分析。然后將酶膜固定在網(wǎng)框上并懸掛于燒杯中，用來(lái)聚合米糠廢水中的蛋白質(zhì)，以米糠廢水中的蛋白質(zhì)聚合率為指標(biāo)，分別考察物料溫度、物料pH值、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速以及酶膜面積對(duì)蛋白質(zhì)聚合率的影響，并利用響應(yīng)面對(duì)各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳條件。在物料溫度43 ℃、pH 6.6、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速124 r/min、酶膜面積與底物含量比例80∶1（cm2/g）、反應(yīng)時(shí)間1.8 h條件下，蛋白質(zhì)聚合率可達(dá)70%，表明本實(shí)驗(yàn)有效保留了米糠廢水中的蛋白質(zhì)含量，相應(yīng)米糠廢水中相關(guān)指標(biāo)也有所降低：COD值為3 859 mg/L，BOD為1 982 mg/L。與此同時(shí)，對(duì)酶膜重復(fù)使用性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，在使用5 次后，酶膜的相對(duì)酶活力為74.3%。本實(shí)驗(yàn)為之后利用酶膜降低米糠廢水中蛋白質(zhì)含量從而保留更多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。