劉 蕾，李婭琳，聶 蓉，錢 楊，厙 曉，陶雨飛，饒 瑜*

（西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039）

四川泡菜是中國泡菜的典型代表，歷史悠久，文化深厚，被譽為“川菜之骨”，堪稱“國粹”[1]。四川泡菜因其獨特的風味深受人們喜愛，其產(chǎn)業(yè)已成為四川乃至我國特色產(chǎn)業(yè)支柱之一。由于其在發(fā)酵、發(fā)酵后加工和貨架期貯存中都保有豐富的微生物數(shù)量和多樣性，在一定條件下，被抑制的腐敗微生物能打破原有的微生物生態(tài)平衡而引發(fā)腐敗[2]。目前對四川泡菜腐敗的預防和控制，主要通過在發(fā)酵過程中采取措施和產(chǎn)品的防腐保鮮兩個方面。但現(xiàn)有的防腐保鮮方法已遇到各種瓶頸，因此，尋求新型的生物防腐劑，開發(fā)新型的生物防腐技術(shù)，已迫在眉睫[3]。

四川泡菜作為傳統(tǒng)的天然發(fā)酵食品，含有種類繁多的微生物。泡菜微生物組結(jié)構(gòu)解析的相關(guān)研究已開始開展，研究表明乳酸菌主導了泡菜發(fā)酵進程，且本研究室前期也鑒定出多株與泡菜腐敗有關(guān)的微生物[4]。在泡菜發(fā)酵環(huán)境中，微生物之間可以通過群體感應（quorum sensing，QS）系統(tǒng)進行交流，QS系統(tǒng)是細菌依賴于群體密度而調(diào)控其生理行為的一種機制。其中LuxS/AI-2型QS廣泛存在于G＋和G-菌中，在微生物跨種間信號交流方面發(fā)揮重要作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)食品腐敗可能受QS系統(tǒng)調(diào)控。在不同的食品例如牛奶、肉和蔬菜中發(fā)現(xiàn)了QS信號分子AI-1和AI-2，同時發(fā)現(xiàn)一些與食品腐敗相關(guān)的酶如果膠酶、聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、脂肪酶、幾丁質(zhì)酶、核酸酶、蛋白酶受QS調(diào)控[5-8]。群體感應抑制劑（quorum sensing inhibitor，QSI）能用于防止食品表面腐敗菌或病原菌的定植、毒素產(chǎn)生和腐敗菌的增殖，因此具備作為新型生物防腐劑的巨大潛力[9]。然而，關(guān)于QS阻斷后會對發(fā)酵環(huán)境中的微生物菌群產(chǎn)生何種影響的相關(guān)研究尚處于起步階段。

前期研究已發(fā)現(xiàn)D-核糖是一種通用QSI[10-11]，且常被作用醫(yī)藥原料、保健品、中間體和食品添加劑[12-13]。已有報道稱肉桂醛也是一種QSI[14-18]，能夠有效抑制微生物的生理行為[19-24]。本研究在發(fā)酵泡菜中分別加入D-核糖及肉桂醛，檢測其對菌群多樣性的影響，并進一步分析其對特定腐敗菌生理特性的影響，以期為今后QS抑制效應在發(fā)酵泡菜防腐保鮮領(lǐng)域相關(guān)研究提供參考，并為發(fā)酵食品防腐保鮮技術(shù)開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 泡菜樣品

樣品來自成都紅光地區(qū)發(fā)酵泡菜，泡菜原料為大白菜，發(fā)酵方式為添加6 g/100 mL食鹽后天然發(fā)酵。

1.1.2 培養(yǎng)基

M R S培養(yǎng)基：包括蛋白胨1 0 g/L，酵母提取物5 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，牛肉浸膏10 g/L，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 mL/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L。

LB培養(yǎng)基：包括胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.4，121 ℃滅菌15 min后備用。

1.1.3 試劑

D-核糖、肉桂醛（均為食品級） 成都科龍化工試劑廠；2×Taq MasterMix（Dye） 康為世紀生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設備

Appiled Biosystems GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Thermo Fisher公司；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統(tǒng)美國Promega公司；SpectraMax iD3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜樣品處理

根據(jù)前期研究結(jié)果及文獻[10]，將D-核糖和肉桂醛的作用濃度分別確定為200 mmol/L和100 μmol/L。將泡菜樣品（含泡菜液及泡菜）進行分裝，之后分別添加D-核糖至終濃度200 mmol/L，即為D-核糖處理組，平行3 個樣本；添加肉桂醛至終濃度100 μmol/L，為肉桂醛處理組，平行3 個樣本；不添加D-核糖及肉桂醛的為對照組，平行3 個樣本。室溫保存1 個月至泡菜樣品出現(xiàn)變色、氣味不良、pH值升高的腐敗現(xiàn)象。

1.3.2 泡菜發(fā)酵液微生物基因組提取與測序

測序的基本實驗流程為：泡菜發(fā)酵液DNA抽提→設計合成引物接頭→PCR擴增與產(chǎn)物純化→PCR產(chǎn)物定量與均一化→構(gòu)建PE文庫→Illumina測序。

DNA抽提：經(jīng)過PCR操作提取出DNA產(chǎn)物后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提出的PCR產(chǎn)物。PCR擴增：按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。PCR采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫。熒光定量：根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。

MiSeq文庫構(gòu)建：通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標區(qū)域外端，使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生DNA片段。

MiSeq測序：DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；以DNA片段為模板，芯片上固定的堿基序列為引物進行PCR合成，在芯片上合成目標待測DNA片段；變性、退火后，芯片上DNA片段的另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋”；PCR擴增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個堿基；用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第1輪反應所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3’端黏性，繼續(xù)聚合第2個核苷酸；統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.3.3 生物信息學分析

MiSeq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析，基于OTU可以進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

1.3.4 特定腐敗菌的分離與鑒定

以上述靜置1 個月的泡菜液為來源分離特定腐敗菌。采用無菌生理鹽水對原始泡菜液進行10 倍梯度稀釋，并涂布于LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，直至長出單克隆菌落。對挑取菌落進行轉(zhuǎn)接、液體培養(yǎng)，菌液為PCR擴增模板。分別以27F（3’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-5’）和1541R（3’-AAGGAGGTGATCCACCC-5’）為上下游引物對上述菌液的16S rDNA序列進行PCR擴增，擴增體系為：27F 1 μL，1541R 1 μL，菌液模板2 μL，2×Mix 15 μL，ddH2O 11 μL。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。之后進行瓊脂糖凝膠電泳。后直接將PCR產(chǎn)物或切膠產(chǎn)物送去成都擎科梓熙有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

1.3.5 生長曲線測定

將上述分離得到的特定腐敗菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，處理組分別添加終濃度為200 mmol/L的D-核糖或100 μmol/L的肉桂醛，將其置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)36 h，每2 h取樣，測定OD600nm。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以OD600nm值為縱坐標，分別繪制生長曲線。

1.3.6 生物被膜測定

生物被膜形成量檢測采用結(jié)晶紫染色法。將上述分離得到的特定腐敗菌分別接種于LB培養(yǎng)基中，處理組分別添加終濃度為200 mmol/L的D-核糖或100 μmol/L的肉桂醛。將培養(yǎng)液加至96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后用磷酸鹽緩沖溶液輕柔沖洗3 次，去除懸浮菌體，室溫晾干。每孔加0.1%結(jié)晶紫溶液，室溫染色30 min，無菌水輕柔沖洗至洗液無色為止，室溫晾干。加100 μL無水乙醇充分溶解結(jié)晶紫。檢測OD595nm值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有測試重復3 次，用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析（ANOVA）及作圖。P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-核糖及肉桂醛對四川泡菜微生物多樣性的影響

微生物多樣性測序的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）信息統(tǒng)計結(jié)果如表1所示，樣品檢測到的微生物共分布于1 個域，1 個界，4 個門，5 個綱，9 個目，11 個科，13 個屬，20 個種，OTU統(tǒng)計為22 個。在OTU水平進行分析，對照組中Pediococcus ethanolidurans（OTU16）的數(shù)目最多（36 735），其次是unclassified Lactobacillus（OTU20）（8 275），不含有L. paucivorans（OTU18）。D-核糖處理后有明顯的變化，其中unclassified Lactobacillus（OTU15）的數(shù)目最多（34 646），其次是P. ethanolidurans（OTU16）（8 842），而不含有S. equorum（OTU4）、L. ginsenosidimutans（OTU6）、P. acnes subsp. acnes（OTU8）、L. lactis subsp. lactis（OTU9）。與對照組相比，肉桂醛處理后作用不明顯，其中P. ethanolidurans（OTU16）的豐度仍然最大（28 955），其次為unclassifiedLactobacillus（OTU20）（2 827），不含有L. paucivorans（OTU18）。

表1 微生物多樣性測序的OTU信息統(tǒng)計Table 1 OTU information from microbial diversity analysis

如圖1所示，對照組P. ethanolidurans占比最多，為76.35%，其次為unclassifiedLactobacillus，占比為19.38%，此外，還檢測出L. sakei，占比1.70%，以及B. gunnisoniana，占比1.45%。肉桂醛處理后的群落分布中P. ethanolidurans占比依然最多，上升為85.34%，unclassifiedLactobacillus、L. sakei及B. gunnisoniana占比分別變?yōu)?0.22%、2.23%及1.28%。D-核糖處理組的變化顯著，其中占比最多的是unclassifiedLactobacillus，占到80.10%，而P. ethanolidurans的占比降為19.21%。該結(jié)果表明D-核糖和肉桂醛會對四川泡菜的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且D-核糖的作用強于肉桂醛。

圖1 泡菜樣品在屬水平的微生物群落分布餅圖Fig. 1 Genus-level distribution of microbial community in Sichuan pickle

圖2 肉桂醛處理組與對照組在屬水平的微生物Veen圖（A）和Heatmap圖（B）Fig. 2 Veen chart (A) and Heatmap (B) of microbial communities in control vs. cinnamaldehyde treatment groups at genus level

圖3 D-核糖處理組與對照組在屬水平的微生物Veen圖（A）和Heatmap圖（B）Fig. 3 Veen chart (A) and Heatmap (B) of microbial communities in control vs. D-ribose treatment groups at genus level

如圖2所示，經(jīng)肉桂醛處理后與處理組有18 個屬為共同所有，Heatmap圖表明樣本群落結(jié)構(gòu)變化不明顯，Lactobacillus的占比下降，P. ethanolidurans占比上升。如圖3所示，經(jīng)D-核糖處理后與處理組有15 個屬為共同所有，Heatmap圖表明樣本群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，且Lactobacillus占比顯著上調(diào)，這表明D-核糖對維持泡菜中的Lactobacillus比例具有積極的作用。

2.2 D-核糖及肉桂醛對四川泡菜源腐敗微生物生長曲線的影響

圖4 D-核糖及肉桂醛對P. calida（A）、P. ananatis（B）、P. anthophila（C）及S. saprophyticus（D）生物曲線的影響Fig. 4 Effects of D-ribose and cinnamaldehyde on growth curves of P. calida (A), P. ananatis (B), P. anthophila (C) and S. saprophyticus (D)

從四川泡菜樣本中分離出多株特定腐敗菌，選擇其中4 株進行后續(xù)研究。分別為Pantoea calida、Pantoea ananatis、Pantoea anthophila以及Staphylococcus saprophyticus。

如圖4所示，D-核糖對4 種微生物的生長均無顯著影響，而肉桂醛對它們的生長有顯著的抑制作用。其中，對P. calida從開始就表現(xiàn)出明顯的抑制作用（圖4A），對P. ananatis、P. anthophila及S. saprophyticus初期（0～10 h）生長沒有明顯的抑制作用，但是直至穩(wěn)定期，三者的OD600nm數(shù)值均顯著低于對照組。從OD600nm看，肉桂醛處理后P. calida菌量只能達到對照組的一半，P. ananatis、P. anthophila及S. saprophyticus的菌量也與對照組有顯著差異。然而，2.1節(jié)中關(guān)于微生物不同屬的相對占比結(jié)果卻顯示肉桂醛的影響不明顯，這說明肉桂醛對單個微生物的抑菌作用并不會顯著影響其菌群相對占比情況，菌群結(jié)構(gòu)的變化更有可能是微生物群體信號交流改變的結(jié)果。

2.3 D-核糖及肉桂醛對四川泡菜源腐敗微生物生物被膜形成的影響

圖5 D-核糖及肉桂醛對P. calida（A）、P. ananatis（B）、P. anthophila（C）及S. saprophyticus（D）生物被膜的影響Fig. 5 Effects of D-ribose and cinnamaldehyde on bio film formation of P. calida (A), P. ananatis (B), P. anthophila (C) and S. saprophyticus (D)

如圖5所示，P. calida在加入D-核糖和肉桂醛之后，其生物被膜OD595nm值分別為0.353 3和0.313 7，對比對照組的OD595nm值3.132 5，分別降低至11%和10%，二者作用效果明顯。P. ananatis在加入D-核糖和肉桂醛之后，生物被膜OD595nm值分別為0.401 8和0.330 5，對比對照組OD595nm值1.914 3，降低至21%和17%，作用效果也較明顯。P. anthophila在加入D-核糖和肉桂醛之后，其OD595nm值分別為0.313 5和0.257 7，對比對照組的OD595nm值2.805 2，分別降低至11%和9%，作用效果明顯。S. saprophyticus在加入D-核糖和肉桂醛之后，其OD595nm值分別為0.305 8和0.418 0，對比未加入對照組的OD595nm值2.856 7，分別降低至11%和15%，作用效果很明顯。綜上，D-核糖和肉桂醛對4 種腐敗菌的生物被膜形成均具有顯著的抑制作用（P＜0.01）。

3 討 論

多數(shù)研究表明，乳酸菌是發(fā)酵泡菜的主要微生物[25-27]。有研究人員對家庭制作的四川泡菜微生物組進行深度測序，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和變形菌門的微生物占99%，從種的角度看，占比最多的是Lactobacillus，其次是Pediococcus；從屬的角度看，L. acetotolerans占比最多，其次是L. brevis和P. ethannolidurans[28]。在泡菜發(fā)酵的最后階段，L. plantarum和L. casei為主要微生物[29]。也有報道稱L. acteotolerans和L. brevis是家庭制作泡菜的主要微生物[28]。有研究人員對不同原料的四川發(fā)酵泡菜的細菌多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus在榨菜、蘿卜中為絕對優(yōu)勢菌，在豇豆中為主要優(yōu)勢菌[30]。本研究室曾對不同鹽質(zhì)量濃度泡菜正常發(fā)酵中的微生物數(shù)量、分布及變化進行了分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus plantarum和Lactobacillus pentosus為主的乳酸菌主導了泡菜發(fā)酵過程，而Bacillus subtilis和Candida tanzawaensis等菌株與泡菜腐敗有關(guān)[2]。在本研究中，檢測的對照樣品在室溫條件下存放1 個月，其主要微生物為P. ethanoliduran，而Lactobacillus占比為第2位，這表明泡菜中的微生物群落發(fā)生了變化，不利于泡菜品質(zhì)控制。而加入D-核糖的處理組中，依然是Lactobacillus占比最多，表明D-核糖可能具有維持泡菜品質(zhì)，延長貨架期的潛在應用價值。

關(guān)于核糖調(diào)控菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究鮮見報道，但前期已有研究表明核糖可作為QSI調(diào)節(jié)單個微生物的生理行為。有報道稱D-核糖能夠抑制信號分子AI-2從而減弱很多種微生物生物被膜的形成，例如Fusobacterium nucleatum、Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola[31-32]。在Aggregatibacter actinomycetemcomitans中，核糖對其生長沒有顯著影響，但可以與AI-2競爭受體LsrB和RbsB，從而抑制AI-2誘導的胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，從而抑制其生物被膜的形成[33-34]。前期研究也發(fā)現(xiàn)200 mmol/L的D-核糖對Lactobacillus paraplantarumL-ZS9和Bifidobacterium animalisRH的生長情況沒有顯著影響，但可以抑制它們的生物被膜形成[10,35]。且通過蛋白質(zhì)組學鑒定出L. paraplantarumL-ZS9中受D-核糖調(diào)控的基因[10]。本研究特定腐敗菌生長曲線及生物被膜形成的相關(guān)結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，表明D-核糖可以在不顯著影響其生長的情況下抑制被膜的形成，這說明D-核糖對被膜形成的抑制作用可能是通用的。而關(guān)于D-核糖是通過抑制QS還是同時伴隨著代謝途徑的改變從而影響這幾株菌的生理行為，還有待進一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在泡菜發(fā)酵環(huán)境中，D-核糖可以對其菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，且可以將Lactobacillus的占比大幅提高。

肉桂油因其特殊的芳香廣泛應用于食品工業(yè)領(lǐng)域[36-38]。肉桂醛是一種無毒的風味物質(zhì)，被認為是安全的，廣泛應用于食品、飲料、口香糖、香料及食品化學領(lǐng)域[39]。有研究表明肉桂醛能夠有效抑制兩種?；呓z氨酸內(nèi)酯介導的QS及AI-2介導的QS[40]，它能夠在不影響細菌生長的前提下通過減弱LuxR的DNA結(jié)合能力從而干擾Vibriospp.的AI-2介導的QS[17]。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂油能夠有效拮抗Streptococcus mutans和L. plantarum的生物被膜[41]。肉桂醛能夠影響B(tài)urkholderia multivorans、Burkholderia cenocepacia、Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli和Vibriospp.的生物被膜形成，且會提升被膜對抗生素處理的敏感性[15-17,42-45]。也有研究發(fā)現(xiàn)，生長于中國臺灣的土肉桂能夠明顯抑制9 種革蘭氏陽性及陰性菌的浮游態(tài)生長，其中包括methicillin-resistantStaphylococcus aureus和Staphylococcus epidermidis[37]。肉桂醛的作用機制可能是抑制質(zhì)子動力勢、呼吸鏈、電子傳遞和基質(zhì)氧化，從而導致氧化磷酸化去偶聯(lián)、主動運輸抑制、代謝產(chǎn)物丟失、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖的代謝受阻[46-50]。肉桂作為調(diào)味品添加進泡菜制品中[51]。關(guān)于肉桂醛及其衍生物對各種發(fā)酵環(huán)境中的微生物組的相關(guān)研究非常匱乏。曾有研究發(fā)現(xiàn)在瘤胃發(fā)酵環(huán)境中，肉桂醛可以抑制革蘭氏陽性菌及陰性菌，但是具有濃度依賴性[52]。且有研究發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物會對一些植物提取物在第7天左右產(chǎn)生適應，從而其對微生物發(fā)酵的影響消失[53]。本研究結(jié)果表明肉桂醛對泡菜環(huán)境中微生物組成的影響不顯著，這有可能是所選擇濃度不是最適宜作用濃度，也有可能是添加時間較長導致微生物組的產(chǎn)生適應。

4 結(jié) 論

本研究通過分別外源添加D-核糖和肉桂醛這兩種QSI于四川泡菜發(fā)酵液中，經(jīng)微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)D-核糖處理可以使樣本群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，且Lactobacillus相對占比明顯上調(diào)，這表明D-核糖對維持泡菜中的Lactobacillus比例具有積極的作用；而肉桂醛的作用并不明顯。進一步分析D-核糖及肉桂醛對分離自樣品中的特定腐敗菌的生長性能的影響，發(fā)現(xiàn)D-核糖及肉桂醛均可以顯著抑制特定腐敗菌P. calida、P. ananatis、P. anthophila及S. saprophyticus的生物被膜形成。以上研究為今后QS抑制效應在發(fā)酵泡菜防腐保鮮領(lǐng)域相關(guān)研究提供參考，并為發(fā)酵食品防腐保鮮技術(shù)開發(fā)提供新的思路。