李康梅 陳秀榕 戴明明 黎明星 黃愉淋 白琳 吳媛媛 何國(guó)珍

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（南寧530200）；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南寧530023）；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（南寧530001）

卵巢的卵泡由卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及膜細(xì)胞組成，睪丸由生精小管和生精小管之間的睪丸間質(zhì)組成，支持細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞及肌樣細(xì)胞為其主要生殖細(xì)胞。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）為多肽生長(zhǎng)因子，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（HGF-receptor，也稱c-Met）為HGF 唯一的受體，二者通過(guò)特異性結(jié)合，可調(diào)控性腺發(fā)育以及生殖細(xì)胞的增殖，促進(jìn)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖以及侵襲。本綜述主要對(duì)HGF/c-Met 信號(hào)通號(hào)通路調(diào)控生殖細(xì)胞發(fā)生的研究進(jìn)展進(jìn)行概括。

1 HGF/c-Met 信號(hào)通路

HGF 最早從大鼠的血漿中發(fā)現(xiàn)，主要源自肝臟的儲(chǔ)脂細(xì)胞，可強(qiáng)烈刺激肝細(xì)胞DNA 的合成，后又因能刺激原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，被稱為HGF［1-2］。HGF 為多肽生長(zhǎng)因子，前體為單鏈無(wú)活性蛋白，由一條728 個(gè)氨基酸編碼而成，經(jīng)絲氨酸蛋白水解酶水解，再由二硫鍵連接，最終形成具備活性的雙鏈分子（由α-β鏈組成的一個(gè)異質(zhì)二聚體）［3-4］（圖1）。α鏈較長(zhǎng)，含有一個(gè)典型的信號(hào)肽，在分泌過(guò)程中裂解形成5 個(gè)結(jié)構(gòu)域：與纖溶酶原激活肽同源的一個(gè)N 端發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)域（N）與4 個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域（K）；β鏈較短，與典型的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域相似［5］。

圖1 HGF 的結(jié)構(gòu)圖［6］Fig.1 Molecular structure of the HGF［6］

c-Met 是受體酪氨酸激酶的獨(dú)特亞家族，由原癌基因MET 編碼產(chǎn)生，具備自主磷酸化活性；主鏈前體蛋白為Ⅱ型酪氨酸激酶受體，以二硫鍵結(jié)合α 和β 兩個(gè)亞基所組成單鏈構(gòu)成主要結(jié)構(gòu)，包含細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)蛋白激酶結(jié)構(gòu)區(qū)以及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。c-Met 蛋白的細(xì)胞外區(qū)域（圖2）由3 個(gè)功能區(qū)域組成：包含所有α 亞基和β 亞基N端部分β 螺旋折疊區(qū)域（Scma domain）、含4 個(gè)二硫鍵的富胱氨酸結(jié)構(gòu)域（plcxins，scmaphorins and intcgrins domain）、與跨膜螺旋區(qū)相連接的4 個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（immunoglobulin-plcxin-transcription domain）；β 亞基的細(xì)胞內(nèi)區(qū)具有酪氨酸激酶活性并能轉(zhuǎn)換HGF 的所有效應(yīng)。c-Met 蛋白的細(xì)胞內(nèi)區(qū)則由近膜結(jié)構(gòu)區(qū)、激酶催化結(jié)構(gòu)區(qū)及C-末端結(jié)構(gòu)區(qū)組成，近膜結(jié)構(gòu)域有2 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，參與c-Met 表達(dá)的下調(diào)和內(nèi)化；酪氨酸激酶催化位（Tyr1235、Tyr1234 以及Tyr1230）通過(guò)磷酸化能正向調(diào)控酶的活性；C-末端結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)獨(dú)特的結(jié)合位點(diǎn)，其中的Tyr1349 與Tyr1356 磷酸化能吸引多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和適配蛋白，進(jìn)而激活多條下游信號(hào)通路［4，7］。

圖2 c-Met 結(jié)構(gòu)圖［8］Fig.2 Molecular structure of the c-Met［8］

HGF 與c-Met 通過(guò)兩個(gè)激酶位點(diǎn)產(chǎn)生特異性結(jié)合，一個(gè)是經(jīng)過(guò)泛素連接酶（casitas B-lineage lymphoma，CBL）與酪氨酸激酶催化區(qū)（tyrosine kinase domain；consist of tyr 1234 and tyr1235，TKCD）結(jié)合，分泌泛素化酶，激活HGF-c-Met-CBL 通路的負(fù)調(diào)節(jié)作用，抑制c-Met 及其他下游受體酪氨酸激酶的活性［4，9］；另一個(gè)則利用有SH2 結(jié)構(gòu)域的多效應(yīng)物質(zhì)與位于Met 尾端的多功能激酶位點(diǎn)相結(jié)合，所形成的c-Met 復(fù)合物，再與如磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）、IκBα-NF-κB 復(fù)合物、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白-2（Grb2-associated binder2，Gab2）等直接或間接結(jié)合，啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)通路，發(fā)揮細(xì)胞的增殖、侵襲能力等作用［4，10］。c-Met 與HGF 結(jié)合后，酪氨酸激酶活性被激活，產(chǎn)生二聚化，c-Met 胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，胞質(zhì)內(nèi)的蛋白激酶結(jié)構(gòu)區(qū)的酪氨酸激酶被激活，為下游信號(hào)傳導(dǎo)底物（Src、Gabl、Gab2）提供停泊位點(diǎn)，激活如PI3K/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threoninespecific protein kinase，AKT），Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，Ras）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信號(hào)通路（圖3）［11-12］，并把增殖信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，調(diào)控特定基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖、分化、遷移、形態(tài)發(fā)生、蛋白質(zhì)合成以及血管生成等［13］。HGF 表達(dá)于周?chē)g質(zhì)細(xì)胞，c-Met 則多表達(dá)于上皮來(lái)源細(xì)胞［3，7］，對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞、卵泡發(fā)生相關(guān)細(xì)胞（如卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞等）、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種細(xì)胞增殖有調(diào)節(jié)作用。在胚胎期與成人期均可在多個(gè)器官如肝臟、胰腺、前列腺中檢測(cè)出c-Met，其表達(dá)對(duì)胎盤(pán)、肝、腎、腦等的正常發(fā)育及造血功能有重要影響［8］。

2 HGF/c-Met 信號(hào)通路對(duì)卵泡發(fā)生的調(diào)控

卵泡作為哺乳動(dòng)物卵巢組織的基本功能單位，包含有膜細(xì)胞、上皮衍生的顆粒細(xì)胞以及周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞所圍繞的卵母細(xì)胞。卵泡發(fā)生是一個(gè)連續(xù)數(shù)周的進(jìn)程，相繼經(jīng)歷原始卵泡、初級(jí)卵泡、三級(jí)卵泡和成熟卵泡幾個(gè)階段。始于原始卵泡被激活，后募集一個(gè)或多個(gè)原始卵泡到生長(zhǎng)卵泡庫(kù)，細(xì)胞增大并增殖，最終止于排卵或者卵泡閉鎖。通常將該進(jìn)程劃分為促性腺激素不依賴階段與促性腺激素依賴階段。

卵泡發(fā)生有著精密的時(shí)序調(diào)控。優(yōu)勢(shì)卵泡排卵后，卵泡破裂排出后，卵巢表面上皮的損傷以及殘留在卵巢內(nèi)的部分分化成為黃體。整個(gè)卵泡發(fā)生的過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)持續(xù)進(jìn)行的包含血管發(fā)生、損傷修復(fù)以及衰退的組織生長(zhǎng)過(guò)程。HGF/c-Met 信號(hào)通路可能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)血管形成、提高毛細(xì)血管密度及血流速度來(lái)影響損傷的修復(fù)，并影響胚胎的發(fā)育［14-15］。雖然哺乳動(dòng)物卵巢的顆粒細(xì)胞不含血管，但膜細(xì)胞層外有豐富的血管，膜細(xì)胞外的血管發(fā)育與卵泡發(fā)育有較大聯(lián)系。此外，HGF 與c-Met 還在多種動(dòng)物如大鼠、豬、牛以及人類的前列腺、睪丸、子宮內(nèi)膜、膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞內(nèi)有不同程度表達(dá)，HGF 可通過(guò)自/旁分泌調(diào)節(jié)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖，HGF 在卵巢的表達(dá)與妊娠率低、女性性腺疾病發(fā)病相關(guān)，還可能影響卵泡發(fā)生［14，16］。

圖3 HGF/c-Met 信號(hào)通路圖［8］Fig.3 Molecular of the HGF/c-met signaling pathway

2.1 HGF/cMet 信號(hào)通路與卵泡膜細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)HGF 與c-Met 在人卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞上表達(dá)，HGF 可能直接通過(guò)改變類固醇形成基因近而調(diào)節(jié)膜細(xì)胞雄激素和孕酮的分泌［17］。在卵泡發(fā)生的早期啟動(dòng)中，HGF 可直接作用于膜細(xì)胞，但對(duì)膜細(xì)胞分泌類固醇激素調(diào)節(jié)是間接的［18-19］。將絨毛膜促性腺激素作用于未成熟大鼠，可提高HGF 與c-Met 在囊狀卵泡膜細(xì)胞上的表達(dá)［5］。HGF 還可促進(jìn)生殖細(xì)胞分化以及由間質(zhì)細(xì)胞衍生的膜細(xì)胞分泌，在卵泡發(fā)育期間刺激上皮顆粒細(xì)胞增殖［16］。

2.2 HGF/c-Met 信號(hào)通路與顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞可通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、旁分泌因子等來(lái)調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟。最早報(bào)道HGF 在卵巢中的效應(yīng)是其可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛顆粒細(xì)胞的增殖，并且有研究發(fā)現(xiàn)HGF 及其受體c-Met 的mRNA 在人排卵前卵泡顆粧細(xì)胞中表達(dá)［3］。HGF與c-Met 在小鼠早期卵巢就有表達(dá)，隨年齡增大c-Met 表達(dá)逐漸增強(qiáng)，HGF 增強(qiáng)不明顯，與干細(xì)胞因子/KIT 配體（KIT ligand）相互作用可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和早期卵泡發(fā)生［17］。 HGF 可正向調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖與分化，抑制卵泡的閉鎖，并可表達(dá)在不成熟的大鼠卵巢的竇前卵泡間質(zhì)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中，促進(jìn)竇前卵泡間質(zhì)膜細(xì)胞分泌孕酮，但抑制了雄激素的產(chǎn)生，表明HGF 可逆性的抑制由黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）刺激的雄激素的產(chǎn)生從而促進(jìn)卵泡發(fā)生［19-20］。

2.3 HGF/cMet 信號(hào)通路與卵泡發(fā)生機(jī)制卵泡發(fā)生過(guò)程伴隨著卵巢顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生各種卵巢局部生長(zhǎng)因子，建立并維持卵母細(xì)胞成熟所需要的局部微環(huán)境。HGF 為旁分泌調(diào)節(jié)因子，對(duì)間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的膜細(xì)胞和上皮性的顆粒細(xì)胞的相互影響有重要的意義，HGF 和c-Met可同時(shí)促進(jìn)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的發(fā)育［16］。在未成熟大鼠卵巢中，應(yīng)用免疫組化發(fā)現(xiàn)c-Met 在小的腔前卵泡的顆粒細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)，在用孕馬血清作用誘導(dǎo)囊狀卵泡的生長(zhǎng)之后，HGF 與c-Met 的表達(dá)顯著轉(zhuǎn)變，在顆粒細(xì)胞的表達(dá)相對(duì)下降，但在囊狀卵泡外的膜細(xì)胞的表達(dá)相對(duì)增高［18］，表明HGF 與c-Met 不僅可表達(dá)在顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞，同時(shí)二者的表達(dá)水平受體內(nèi)激素的影響。膜細(xì)胞所分泌的HGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factoralpha，TGF）、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor）等因子。雌激素和促性腺激素可以刺激這些細(xì)胞因子的表達(dá)，表明激素和局部的旁分泌因子都是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的相互作用，從而調(diào)節(jié)或刺激原始卵泡的發(fā)生以及發(fā)育［16，21］。

ZACHOW 等［22］研究顯示，卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和HGF 均可各自降低體外培養(yǎng)大鼠顆粒細(xì)胞上c-Met 的表達(dá)，相反，環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate）則可增加c-Met 的表達(dá)程度。c-Met 在體外受精成功的卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞的表達(dá)遠(yuǎn)比受精不成功的卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞要強(qiáng)，提示HGF/cMet 信號(hào)通路可能是卵母細(xì)胞成熟并能受精成功的一個(gè)重要因素［23］。

3 HGF/cMet 信號(hào)通路對(duì)精子發(fā)生的調(diào)控

精子發(fā)生根據(jù)細(xì)胞增殖和分化特征分為3 個(gè)時(shí)期：（1）有絲分裂期：原始生殖細(xì)胞多次有絲分裂分化成為精原細(xì)胞；（2）減數(shù)分裂期：精原細(xì)胞再分化形成精母細(xì)胞，精母細(xì)胞又通過(guò)減數(shù)分裂形成圓形精子細(xì)胞；（3）精子形成期：圓形精子細(xì)胞變態(tài)分化形成蝌蚪狀的精子，此時(shí)的精子已經(jīng)具有一定的運(yùn)動(dòng)能力。精子從生精小管上皮釋放進(jìn)入管腔，再進(jìn)入附睪繼續(xù)發(fā)育，最終發(fā)育為成熟精子。

精子發(fā)生的主要受激素和旁分泌因子兩方面調(diào)節(jié)。一是通過(guò)下丘腦-垂體-睪丸軸來(lái)調(diào)節(jié)精子發(fā)生的啟動(dòng)和維持，下丘腦分泌促性腺激素釋放激素，刺激垂體分泌的FSH 和LH，LH 又促使睪九間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮，最終調(diào)節(jié)精子的發(fā)生。二是通過(guò)激素受體和受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，局部的旁分泌、自分泌激素以及生長(zhǎng)因子（如HGF、FGFs 等）調(diào)節(jié)精子發(fā)生。

HGF 為多生物學(xué)效應(yīng)的生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖以及血管生成［24-25］。HGF/c-Met信號(hào)通路在睪丸發(fā)育的所有階段均有活躍的表達(dá)［22，26］。HGF 為自/旁分泌生長(zhǎng)因子，可調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)分泌狀態(tài)，可直接作用于男性生殖細(xì)胞，或間接對(duì)睪丸管狀細(xì)胞和間質(zhì)體細(xì)胞產(chǎn)生作用。HGF 可促進(jìn)胎兒和成人睪酮的分泌。在離體培養(yǎng)的支持細(xì)胞系中加入外源性HGF 能夠培養(yǎng)出類管樣組織，猜測(cè)這可能與HGF 促分化和促血管形成的功能有關(guān)［27］。在嚙齒類動(dòng)物中，胎兒的男性化和血漿雄激素（睪酮）的增加發(fā)生在下丘腦-垂體-睪丸軸發(fā)揮作用之前。轉(zhuǎn)基因缺乏促黃體生成素受體小鼠在出生時(shí)仍呈現(xiàn)正常的睪丸表型雄激素水平，表明在下丘腦-垂體-睪丸軸產(chǎn)生正常的生理作用之前，胚胎雄性睪酮的增加以及胎兒睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分化，主要受局部生長(zhǎng)因子的調(diào)控，HGF 極有可能參與其中［12，28］。

3.1 HGF/cMet 信號(hào)通路與睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪丸間質(zhì)細(xì)胞能合成和分泌雄激素-睪酮，調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程［29］。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡或消失會(huì)造成雄性激素能力低下［30］。在胚胎形態(tài)發(fā)生時(shí)，HGF 在上皮-間充質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。HGF 可誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并使間質(zhì)細(xì)胞分泌得睪酮量顯著增加，降低睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡，可能與HGF抑制caspase-3 的活性有關(guān)［11，13，31］。此外，HGF 還可促使間質(zhì)細(xì)胞分泌蛋白酶，提高TGF-β的活性，調(diào)控支持細(xì)胞之間緊密連接，影響血-睪屏障的形成［27］。在離體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)HGF 能刺激睪酮合成，促進(jìn)胚胎睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育并延長(zhǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的存活［11，31］。

3.2 HGF/cMe 信號(hào)通路與肌樣細(xì)胞肌樣細(xì)胞圍繞在生精小管周?chē)?fù)責(zé)管狀收縮，幫助運(yùn)送非活動(dòng)精子進(jìn)入附睪，其發(fā)育依賴于雄激素作用，可分泌因子調(diào)控精子發(fā)生和睪丸的發(fā)育。肌樣細(xì)胞系是發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met 系統(tǒng)的第一個(gè)分離的睪丸細(xì)胞類型，HGF 在胚胎時(shí)期和出生后的肌樣細(xì)胞中均有表達(dá)［22］，但c-Met 僅在出生后的肌樣細(xì)胞中檢測(cè)到，表明在胚胎發(fā)育過(guò)程中有旁分泌作用，在出生后的睪丸中有旁分泌/自分泌作用［1-2］。文獻(xiàn)［27］顯示在HGF 的存在下培養(yǎng)的肌樣細(xì)胞，形態(tài)從圓形的、致密的形狀轉(zhuǎn)變?yōu)槔L(zhǎng)的、擴(kuò)大的形狀，HGF 還可激活睪丸肌樣細(xì)胞骨架重構(gòu)和收縮，提高純化的睪丸肌樣細(xì)胞尿激酶型纖溶酶原激活物和尿激酶型纖溶酶原激活物受體的表達(dá)水平，提示HGF 作為肌樣細(xì)胞功能的自分泌調(diào)節(jié)因子，可能是哺乳動(dòng)物睪丸功能的調(diào)控因子。

3.3 HGF/cMet 信號(hào)通路與精子發(fā)生機(jī)制c-Met廣泛表達(dá)于人和嚙齒動(dòng)物的生精細(xì)胞［11］。HGF/c-Met 信號(hào)通路可通過(guò)影響內(nèi)分泌信號(hào)，參與生精細(xì)胞凋亡的調(diào)控。c-Met 在大鼠精子發(fā)生全程中持續(xù)表達(dá)，離體實(shí)驗(yàn)表明，HGF 可調(diào)控生殖細(xì)胞有絲分裂，顯著促進(jìn)增加8 ～30 d 齡的大鼠睪丸精原細(xì)胞的增殖，并參與出生后睪丸生殖細(xì)胞的代謝活動(dòng)的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)睪丸生殖細(xì)胞的增殖并阻止生殖細(xì)胞凋亡過(guò)程［22］。精子發(fā)生在睪丸，成熟于附睪，檢測(cè)HGF 在大鼠附睪中的表達(dá)水平，在遠(yuǎn)端的附睪體、附睪尾中表達(dá)最高，其次是近端的附睪體，但在附睪頭、輸精管以及睪丸中幾乎不表達(dá)，提示哺乳動(dòng)物附睪內(nèi)精子獲能可能與HGF相關(guān)［12，32］。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

目前對(duì)于卵子發(fā)生和精子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制的研究很多，但其機(jī)制仍然未闡明，特別是對(duì)于原始卵泡的啟動(dòng)募集機(jī)制以及精原細(xì)胞增殖啟動(dòng)機(jī)制的研究。綜上所述，HGF/c-Met 信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控生殖細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控卵子發(fā)生和精子發(fā)生，通過(guò)對(duì)這條信號(hào)通路的研究以及其他自/旁分泌因子研究，有望闡明原始卵泡啟動(dòng)募集和精原細(xì)胞啟動(dòng)機(jī)制，為不孕不育、多囊卵巢綜合征以及卵巢早衰等性腺疾病以及其他非性腺疾病的發(fā)病機(jī)制和治療提供理論依據(jù)。