鄒惠安 李琳蕓 唐元艷 陳永玲 梅冰

長江大學第二臨床醫(yī)學院（湖北荊州434020）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是臨床上常見的白血病類型，主要發(fā)生于成人，發(fā)病率隨著年齡的增加而升高。大多數(shù)患者表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、出血，嚴重的出血傾向可致命，因此白血病快速、準確的診斷尤為重要。白血病的診斷需要結合多種檢測方法，包括形態(tài)學、組織學、細胞化學、免疫表型、細胞遺傳學和分子生物學方法［1］。免疫表型主要檢測相關免疫分子，基因重排檢測是評估患者病情和療效的重要分子生物學指標，兩者之間存在一定關聯(lián)，如B 細胞型急性淋巴細胞白血病患者CD25 是融合 基 因BCR/ABL1 標 志 性 抗 原，CD66c、CD13、CD10 和CD38 與BCR/ABL1 相關［2-5］。目前，關于AML 患者免疫分子與融合基因表達關聯(lián)性的研究較少，本研究選取初診FAB 分型為AML 的患者，流式細胞術檢測多個免疫分型免疫分子表達，熒光定量PCR 方法檢測融合基因PML/RARα表達，探討免疫分子與PML/RARα 融合基因之間的關系及免疫分子對PML/RARα融合基因的診斷效能，為AML 患者臨床診療提供新的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料患者來自2016年7月至2019年2月荊州市中心醫(yī)院血液內(nèi)科初診住院病例，納入標準：（1）診斷符合張之南等主編《血液病診斷及療效標準》［6］中AML 的相關診斷標準；（2）明確分型、骨髓和外周血原始細胞比例，細胞和分子遺傳學資料完整。排除標準：骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)化型AML、治療相關AML 及其他類型非原發(fā)AML［7］。本研究共納入120 例符合要求的AML患者，男66 例，女54 例，年齡15 ～76 歲。以39 例PML/RARα陽性患者作為研究組，其中L 型34 例，S 型2 例，V 型3 例，81 例PML/RARα陰性患者作為對照組。采集標本時獲得患者知情同意，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術檢測免疫分型CD 分子表達采取骨髓標本3 mL，EDTA 抗凝，于各檢測管中加入相應單克隆抗體10 μL，并加入標本75 μL，振蕩混勻，室溫避光20 min 后，加入紅細胞裂解液，混勻避光10 min 后，加入1 mL PBS 洗滌，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。胞漿內(nèi)MPO 的染色首先標記表面抗體，加入固定液100 μL，室溫避光15 min，加入3 mL PBS 洗滌離心去掉上清，加入0.1 mL溶血透膜劑5 min，加MPO 抗體室溫避光15 min，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。通過Epics-XL 型流式細胞儀CD45/SSC 設門對104個細胞進行檢測，通過CytExpert 軟件分析細胞的免疫分型CD分子表達。檢測的CD 分子主要有CD19 、CD10、CD5、CD20、CD2、CD4、CD3、CD8、CD7、CD15、CD14、CD13、CD33、HLA-DR、CD56、CD16、CD64、CD11b、CD117、CD34、CD38、cMPO。以表達百分比＞20%判斷為陽性。

1.2.2 總RNA 提取及融合基因PML/RARα 檢測采集EDTA 抗凝骨髓2 ～3 mL，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離單個核細胞。Trizol 法提取總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA 濃度和純度。PML/RARα檢測試劑盒購于廈門至善生物科技股份有限公司，以RNA 為模板檢測PML/RARα融合基因的表達，方法按試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗或Fisher′s 精確檢驗；計量資料采用動差法計算峰度系數(shù)和偏度系數(shù)，進行正態(tài)性檢驗，若符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差表示，比較用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布用M（P25，P75）形式描述，采用非參數(shù)秩和檢驗。通過受試者工作曲線（ROC）評估最佳敏感性和特異性的截止點［8］。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PML/RARα 陽性組與PML/RARα 陰性組免疫分子陽性患者率比較兩組患者均表達CD117分子，均不表達CD14、CD10、CD20、CD3 和CD8 分子。在PML/RARα 陽性患者組中CD64 陽性患者率較高（75.0%），在PML/RARα 陰性患者組中陽性率較低（28.6%）；在PML/RARα 陽性患者組中CD7、CD34、HLA-DR 陽性患者率均較低，在PML/RARα 陰性患者組中陽性率較高。兩組間CD64、CD7、CD34、HLA-DR 陽性率差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 PML/RARα 陽性患者組與陰性患者組免疫分子陽性細胞率比較采用動差法對免疫分子陽性細胞率進行正態(tài)性檢驗，資料不服從正態(tài)分布，組間比較用非參數(shù)秩和檢驗，PML/RARα陽性患者中CD64 陽性細胞率四分位數(shù)均高于PML/RARα 陰性患者，CD7、CD34、HLA-DR陽性細胞率四分位數(shù)均低于PML/RAR α 陰性患者。兩組間CD64、CD34、HLA-DR 陽性細胞率差異均具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 免疫分子診斷AML 患者PML/RARα融合基因重排的ROC 曲線分析CD34、HLA-DR 和CD64對判斷PML/RARα融合基因是否為陽性有一定的準確性（ROC 曲線下面積介于0.7 ～0.9）。CD34 陽性細胞率臨界值10.7%、HLA-DR 陽性細胞率臨界值11.1%和CD64 陽性細胞率臨界值14.2%可用于預測和診斷AML 患者PML/RARα融合基因是否發(fā)生了重排。共陽性CD7/CD34、CD7/HLA-DR 和CD34/HLA-DR 比單標記物具有更高的特異度。見表3。

表1 PML/RARα 陽性患者組與陰性患者組免疫分子陽性患者率比較Tab.1 Comparison of immunomolecule positive patient rates between PML/RARα positive and negative groups

表2 PML/RARα 陽性患者組與陰性患者組免疫分子陽性細胞率比較Tab.2 Comparison of immunomolecule positive cell rates between PML/RARα positive and negative groups M（P25，P75）

表3 CD7、CD34、HLA-DR、CD64 對PML/RARα融合基因的診斷價值Tab.3 Diagnostic value of CD7，CD34，HLA-DR and CD64 to fusion gene PML/RARα

3 討論

AML 是一組以髓系造血干祖細胞惡性增殖為特點的血液系統(tǒng)惡性克隆性疾病，可發(fā)生于任何年齡，無明顯性別差異［9］。PML-RARα對AML 發(fā)病機制可以從細胞、基因轉(zhuǎn)錄與表達的角度闡述：首先，PML-RARα的表達可以導致細胞周期抑制物p21 的上調(diào)，增加基因組的不穩(wěn)定性。p21 對AML 中M2、M3 起著重要的作用，在沒有p21 的情況下，APL 干/祖細胞的長期生存能力明顯減弱［10］。其次，PML-RARα 能夠抑制某些miRNA 的轉(zhuǎn)錄，間接影響在白血病發(fā)生中具有重要功能的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。例如PML-RARα 可通過調(diào)節(jié)miR-196a的表達進而起到調(diào)控HOXB8 效果［11-12］。最后，PML-RARα 可以通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，干擾/抑制了其他轉(zhuǎn)錄因子的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子通路。研究發(fā)現(xiàn)PML-RARα 能夠與轉(zhuǎn)錄因子AP-1、GATA2、Sp1、NF-Y 和PU.1 等相互作用從而干擾了它們自身的轉(zhuǎn)錄活性和其對靶基因的調(diào)控，其中PU.1 是抑制髓系細胞發(fā)育分化至關重要的轉(zhuǎn)錄因子，PML-RARα 與PU.1 相互作用，干擾其靶基因的正常轉(zhuǎn)錄，從而影響AML 細胞發(fā)展［12-15］。因此，PML-RARα對AML 部分亞型的發(fā)病和預后至關重要。

AML 常見高表達抗原有CD33、CD13 和MPO。但CD13、CD33 也高表達于ALL，對AML 診斷無特異性，因此不能單獨作為診斷AML 指標［16-17］。CD34 和HLA-DR 屬于干/祖細胞的相關抗原，二者多在低分化的亞型中表達［18］；CD33+CD13+CD34-HLA-DR-被認為是APL 特征性的免疫表型［19］，本研究符合上述研究結果：所有PML/RARα陽性患者均有此免疫表型，其中CD33、CD13 表達陽性率均為100%，而CD34 與HLA-DR 表達率很低。梁艷［20］、張建軍等［21］開展了類似研究，發(fā)現(xiàn)AML 中NPM1 基因突變陽性患者組的CD34 和HLA-DR陽性患者率明顯低于NPM1 基因突變陰性患者組；AML-1/ETO 融合基因陽性患者的CD34 和HLA-DR 陽性患者率顯著高于APL 患者。目前，尚未見PML/RARα 融合基因的表達分析與AML 白血病細胞免疫表型的研究報道。本研究比較了PML/RARα 融合基因陽性與陰性的AML 患者白血病細胞的免疫分子陽性患者率，發(fā)現(xiàn)與PML/RARα融合基因陰性患者組比較，PML/RARα融合基因陽性患者組的CD64 陽性患者率明顯偏高，而CD7、CD34 和HLA-DR 陽性患者率明顯偏低。

曹春等［22］研究發(fā)現(xiàn)RUNX1-RUNX1T1 陽性患者中CD7、CD34、HLA-DR 陽性細胞率中位數(shù)高于RUNX1-RUNX1T1 陰性患者，CD64 陽性細胞率中位數(shù)低于RUNX1-RUNX1T1 陰性患者，但陽性細胞率中位數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義。本研究分析PML/RARα 融合基因陽性與陰性的AML 患者白血病細胞的陽性細胞率，發(fā)現(xiàn)PML/RARα 陽性患者的CD64 陽性細胞率四分位數(shù)均高于PML/RARα陰性患者，CD7、CD34、HLA-DR 陽性細胞率四分位數(shù)均低于PML/RARα 陰性患者。兩組間CD64、CD34、HLA-DR 陽性細胞率差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

KALINA 等［2］發(fā)現(xiàn)TEL/AML1 和MLL/AF4 陽性患者從未出現(xiàn)CD66c 的表達，而B-ALL 的亞型“Phlike-ALL”中BCR/ABL1 與CD66c 具有相關性。其它研究發(fā)現(xiàn)CD25 是融合基因BCR/ABL1 標志性抗原，CD13，CD10 和CD38 可能與融合基因BCR/ABL1 相關，而CD66c 和CD34 對BCR/ABL1 基因重排的預測性較差［3-5］。此外，研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用多個抗原分子時，會增加相關基因預測的特異性并降低敏感性［5］。本研究發(fā)現(xiàn)共陽性CD7/CD34、CD7/HLA-DR 和CD34/HLA-DR 比單標記物具有更高的特異性。CD34/HLA-DR 具有非常高的特異性和敏感性，因此CD34 和HLA-DR 聯(lián)合檢測可以作為AML 診斷的標志，值得更深入的研究。通過ROC曲線分析CD34、HLA-DR 和CD64 對PML/RARα融合基因陽性的臨床診斷價值，結果表明CD34、HLA-DR 和CD64 對判斷AML 患者PML/RARα是否為陽性有一定的臨床診斷價值（P＜0.01）。因此，CD34 陽性細胞率臨界值10.7%、HLA-DR 陽性細胞率臨界值11.1%和CD64 陽性細胞率臨界值14.2%可用于診斷AML 患者PML/RARα融合基因重排和表達，臨床可根據(jù)上述免疫分子表達水平對PML/RARα融合基因重排進行預判，及時開展融合基因的相關檢測以進一步確診和明確病情，為患者得到及時有效的診療提供幫助。考慮到儀器測量誤差以及樣本的局限性，這些免疫分子的診斷臨界值需要進一步研究和確認。

總之，本研究通過分析AML 初診患者免疫分型與PML/RARα 融合基因的關系，發(fā)現(xiàn)AML 患者中免疫分子CD34、HLA-DR 和CD64 對診斷急性髓系白血病患者PML/RARα 融合基因重排有較好的性能。